Peptidreinheit erklärt: HPLC und Massenspektrometrie

A pureza do peptídeo é o número que todo fornecedor imprime em destaque, e também o número mais mal interpretado. Um valor como 98% vem de um método específico, a HPLC de fase reversa, e responde a uma pergunta específica. Ele não informa a quantidade de peptídeo no frasco e não prova que o pico principal corresponde à molécula certa. Este guia explica como a HPLC separa uma amostra de peptídeo, o que a porcentagem significa, quais impurezas são típicas em peptídeos sintéticos e por que a espectrometria de massas é a segunda metade do quadro.

Como a HPLC de fase reversa mede a pureza do peptídeo

HPLC significa cromatografia líquida de alta eficiência. A amostra é dissolvida e bombeada sob alta pressão por uma coluna preenchida com partículas minúsculas de sílica. Na HPLC de fase reversa, essas partículas são revestidas com cadeias hidrofóbicas de carbono, geralmente C18. As moléculas de peptídeo aderem a esse revestimento. Em seguida, uma mistura de solventes, a fase móvel, percorre a coluna. No início, a fase móvel é majoritariamente água com um pouco de ácido. Ao longo da corrida, a proporção de solvente orgânico, geralmente acetonitrila, é aumentada gradualmente. Isso se chama gradiente.

Cada molécula deixa a coluna no ponto do gradiente em que o solvente fica forte o suficiente para removê-la do revestimento hidrofóbico. Moléculas hidrofílicas eluem cedo. Moléculas hidrofóbicas eluem tarde. Um detector na saída da coluna mede a absorbância UV, geralmente em 214 ou 220 nm, faixa em que a ligação peptídica absorve. O resultado é um cromatograma: uma linha com picos, em que cada pico é um grupo de moléculas que eluiu no mesmo momento. Mant e colaboradores descrevem o método em detalhes no Methods in Molecular Biology (2007, DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1).

O valor de pureza é calculado a partir das áreas dos picos:

Pureza (%) = área do pico principal / soma de todas as áreas dos picos × 100

O que realmente significa 98% de pureza do peptídeo

A porcentagem tem um significado preciso, mas restrito. Ela indica que 98% do material que absorve UV e que saiu da coluna apareceu no pico principal. Quatro limitações decorrem dessa definição:

• É relativa, não absoluta. O número compara picos entre si. Ele não diz quantos miligramas de peptídeo há no frasco.

• Só conta o que absorve UV. Água, sais e contraíons como o TFA não absorvem em 214 nm. Eles são invisíveis ao detector e não reduzem o valor de pureza.

• Só conta o que a coluna consegue separar. Uma impureza com o mesmo tempo de retenção do produto fica escondida dentro do pico principal. Um peptídeo com uma metionina oxidada frequentemente elui muito próximo do peptídeo original.

• Depende do método. Um gradiente mais longo, outra coluna ou outro comprimento de onda podem alterar o número em um ou dois pontos percentuais para a mesma amostra.

Para a maioria dos trabalhos de laboratório, pureza acima de 95% é suficiente. Para ensaios quantitativos ou qualquer aplicação que exija concentração molar conhecida, a meta usual é 98% ou mais. Mais importante que o número é o cromatograma que está por trás dele. Como ler esse documento é abordado no nosso artigo sobre como ler o certificado de análise (COA) de um peptídeo.

Impurezas típicas em peptídeos sintéticos

Peptídeos de pesquisa são produzidos por síntese de peptídeos em fase sólida. A cadeia é construída um aminoácido por vez sobre uma esfera de resina. Cada etapa tem um rendimento de cerca de 99%, e os erros se acumulam ao longo do comprimento da cadeia. D'Hondt e colaboradores revisaram as classes de impurezas de produtos peptídicos no Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis em 2014 (DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012). As mais comuns são:

• Sequências por deleção: um aminoácido está ausente porque uma etapa de acoplamento falhou. O peptídeo fica um resíduo mais curto e geralmente elui um pouco antes ou depois da sequência completa.

• Sequências truncadas: a cadeia parou de crescer cedo. São fragmentos muito mais curtos.

• Sequências por inserção: um aminoácido foi adicionado duas vezes.

• Peptídeos com desproteção incompleta: um grupo protetor da síntese ainda está ligado. São mais hidrofóbicos e eluem tarde.

• Formas oxidadas e desamidadas: metionina, cisteína e triptofano oxidam; asparagina e glutamina sofrem desamidação. Essas formas surgem durante a síntese, a clivagem ou o armazenamento.

• Diastereoisômeros: um aminoácido trocou a forma L pela forma D. São muito difíceis de separar e frequentemente se escondem no pico principal.

Um peptídeo longo, como o CJC-1295, tem mais etapas de acoplamento e mais chances de deleções do que um pentapeptídeo curto, como o Ipamorelin. Essa é uma das razões pelas quais as metas de pureza variam entre produtos. As sequências e os comprimentos de ambos são descritos no nosso guia sobre CJC-1295 e Ipamorelin. O armazenamento também importa, porque a oxidação e a desamidação continuam acontecendo dentro do frasco. Nosso guia sobre como armazenar peptídeos explica como desacelerar esse processo.

A espectrometria de massas confirma a identidade, não a pureza do peptídeo

A espectrometria de massas (MS) ioniza as moléculas da amostra e mede a razão massa/carga. Para peptídeos, utiliza-se ionização por electrospray (ESI) ou MALDI. Se a massa medida corresponder à massa calculada a partir da sequência, a identidade do componente principal está confirmada.

Essa é uma pergunta diferente da pureza. A MS informa que a molécula com a massa esperada está presente. Ela não informa que fração da amostra essa molécula representa, por três motivos:

• Moléculas diferentes ionizam com eficiências diferentes. Uma pequena impureza que ioniza bem pode gerar um pico grande, enquanto o produto pode gerar um pico pequeno.

• Um único peptídeo aparece em várias massas, porque pode carregar um, dois, três ou mais prótons. O espectro não é uma contagem simples.

• Impurezas com a mesma massa do produto, como os diastereoisômeros, dão o mesmo sinal e são invisíveis.

O inverso também é verdadeiro. A HPLC pode mostrar um único pico limpo para uma molécula que não é o peptídeo pretendido. Uma sequência com deleção de uma glicina pode parecer perfeita em um cromatograma. Apenas a massa revela os 57 Da que faltam. Por isso, uma análise completa combina os dois métodos, e os melhores certificados vêm de LC-MS, em que a coluna de HPLC alimenta diretamente o espectrômetro de massas e cada pico recebe a sua própria massa.

Por que a pureza do peptídeo não é o conteúdo líquido de peptídeo

Um frasco rotulado como 10 mg a 98% de pureza não contém 9,8 mg de peptídeo. O valor de pureza refere-se apenas à fração peptídica. O pó no frasco também contém água, contraíons e, às vezes, sais, nada disso visível ao detector de HPLC. O conteúdo líquido de peptídeo é a parcela da massa total que é peptídeo. Para um sal de TFA liofilizado típico, fica entre 70 e 85%. O cálculo completo é este:

Peptídeo real (mg) = massa do rótulo (mg) × conteúdo líquido de peptídeo (%) × pureza (%)

Exemplo: 10 mg × 0,80 × 0,98 = 7,84 mg da sequência correta. Se você planeja uma concentração para um experimento, este é o número a usar. O método do cálculo é explicado no nosso guia sobre como reconstituir peptídeos. Fornecedores que envasam pelo peso líquido de peptídeo, como os listados na nossa coleção de peptídeos testados em laboratório, informam isso no certificado.

Perguntas frequentes sobre a pureza do peptídeo

Fontes

• Mant CT, Chen Y, Yan Z, Popa TV, Kovacs JM, Mills JB, Tripet BP, Hodges RS. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology. 2007. DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1

• D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012

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