Como ler um certificado de análise de peptídeo (COA)

Um certificado de análise de peptídeo (COA) é o documento que indica o que existe realmente dentro de um frasco. Lista os testes que um laboratório realizou num lote específico e os resultados desses testes. Um COA é a única prova objetiva de que o pó corresponde ao rótulo. Este guia explica o que contém um bom COA, como interpretar cada valor, a diferença entre pureza e conteúdo líquido de peptídeo, e quais os sinais que indicam um documento em que não deve confiar.

O que contém um certificado de análise de peptídeo

Um COA está sempre associado a um único lote, também designado por lote de fabrico. Lotes diferentes do mesmo peptídeo têm resultados diferentes, por isso o documento deve indicar o número de lote impresso no seu frasco. Um COA completo para um peptídeo de investigação mostra normalmente os seguintes elementos:

• Nome do produto e sequência: a sequência de aminoácidos ou, pelo menos, o nome e a fórmula molecular

• Número de lote: deve corresponder ao rótulo do frasco

• Massa molecular teórica e observada: obtidas por espectrometria de massa

• Pureza: obtida por HPLC de fase reversa, expressa em percentagem

• Aspeto: normalmente pó liofilizado branco

• Contra-ião: trifluoroacetato (TFA) ou acetato

• Teor de água e conteúdo líquido de peptídeo: se determinados

• Endotoxinas ou biocarga: em alguns certificados

• Data da análise e nome do laboratório de testes

Um COA com identidade e pureza é o mínimo. Um COA com conteúdo líquido e contra-ião é melhor, porque estes valores alteram a forma como calcula as concentrações ao reconstituir peptídeos.

Identidade por espectrometria de massa

A espectrometria de massa (MS) mede a massa da molécula. O COA indica uma massa molecular teórica, calculada a partir da sequência, e uma massa molecular observada, medida pelo instrumento. Os dois valores devem concordar dentro da tolerância do método. Para ESI-MS num peptídeo pequeno, é normal uma diferença inferior a 1 Da. Uma diferença maior indica que a molécula tem uma modificação, como um átomo de oxigénio extra ou um aminoácido em falta.

Muitos certificados mostram o espectro bruto com vários picos. Isto é esperado. Um peptídeo com massa molecular de 1419 Da aparece em 1420 (carga simples, [M+H]+), em 710,5 (carga dupla) e em 474 (carga tripla). Trata-se da mesma molécula com diferentes números de protões ligados.

A MS confirma o que é a molécula. Não indica quanto da amostra corresponde a essa molécula. Essa é a função do HPLC, que explicamos no nosso artigo sobre pureza de peptídeos, HPLC e espectrometria de massa.

Pureza por HPLC num certificado de análise de peptídeo

O HPLC de fase reversa separa a amostra nos seus componentes e deteta-os por absorvância UV, normalmente a 214 ou 220 nm. O resultado é um cromatograma com picos. O valor de pureza no COA corresponde à área do pico principal dividida pela área total de todos os picos. Uma pureza de 98,5% significa que 98,5% do material que absorve UV eluiu como produto principal. Verifique três aspetos:

• O comprimento de onda. A 214 nm deteta a ligação peptídica e vê quase todas as impurezas. A 280 nm deteta apenas triptofano e tirosina e pode ocultar impurezas. Uma pureza medida a 280 nm é menos informativa.

• O próprio cromatograma. Um bom COA mostra o traço. Um pico principal nítido e uma linha de base plana é o resultado desejável. Vários picos próximos do principal indicam sequências com deleções ou formas oxidadas.

• O método. A coluna, o gradiente e o tempo de corrida devem estar indicados. Uma corrida muito curta pode fundir impurezas com o pico principal e fazer a pureza parecer melhor do que é.

Conteúdo líquido de peptídeo versus pureza

Este é o ponto em que a maioria dos leitores se engana. A pureza indica que fração do material peptídico corresponde à sequência correta. O conteúdo líquido de peptídeo indica que fração da massa total do pó é de facto peptídeo. Os dois valores são independentes.

Um pó peptídico liofilizado nunca é 100% peptídeo. Contém também água ligada, contra-iões e, por vezes, sais residuais. Um peptídeo sintético típico com 98% de pureza pode ter um conteúdo líquido de peptídeo de 70 a 85%. Se um frasco estiver rotulado com 10 mg e o conteúdo líquido for de 80%, o frasco contém 8 mg de peptídeo. Se precisar de uma concentração exata, calcule com o conteúdo líquido e não com o peso do rótulo. O conteúdo líquido é normalmente determinado por análise de aminoácidos ou análise de azoto. Se o COA não o indicar, assuma que o rótulo mostra o peso bruto.

Contra-iões: TFA e acetato

Os peptídeos são purificados por HPLC com um ácido na fase móvel. O ácido mais comum é o ácido trifluoroacético (TFA). Após a purificação, o TFA mantém-se ligado aos grupos básicos do peptídeo como contra-ião. Um peptídeo com vários resíduos básicos pode conter 10 a 20% do seu peso como sal de TFA. Roux e colaboradores analisaram, no Journal of Peptide Science em 2008, os métodos para remover ou trocar o TFA (DOI 10.1002/psc.951). O acetato é a alternativa habitual. A troca faz-se numa etapa adicional e custa mais.

O contra-ião é importante por duas razões. Em primeiro lugar, altera o conteúdo líquido de peptídeo e, por isso, a quantidade real no frasco. Em segundo lugar, o TFA não é inerte em ensaios com células. Cornish e colaboradores demonstraram em 1999, no American Journal of Physiology, que o trifluoroacetato residual da purificação alterava o crescimento de osteoblastos e condrócitos em cultura (DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779). Para trabalho com cultura celular, um sal de acetato ou uma etapa de remoção do TFA é a melhor opção. Um COA que não indique o contra-ião deixa-o com dúvidas.

Teor de água, endotoxinas e outros testes

O teor de água é medido por titulação de Karl Fischer e situa-se normalmente entre 3 e 10% num peptídeo liofilizado. Este valor entra no cálculo do conteúdo líquido. As endotoxinas são testadas com o ensaio LAL e expressas em unidades de endotoxina por miligrama. Este teste é relevante em ensaios com células, em que contaminantes bacterianos distorceriam o resultado. Solventes residuais, como a acetonitrila, aparecem em certificados de grau farmacêutico, mas raramente em certificados de grau de investigação.

Testes de terceiros versus testes internos

Um COA pode provir do fabricante, do revendedor ou de um laboratório independente. Os testes internos não são necessariamente errados, mas existe um conflito de interesses. Um COA de terceiros, emitido por um laboratório acreditado e identificado, com número próprio de relatório, é uma prova mais sólida. O melhor cenário é um fornecedor que publique ambos: o certificado do fabricante e uma nova análise independente do mesmo lote. A nossa coleção de peptídeos testados em laboratório lista os produtos para os quais existe análise por lote, por exemplo o BPC-157 10 mg. Verifique se o laboratório existe e se o número de lote corresponde ao seu frasco. Um laboratório de testes idóneo confirma o número do relatório quando solicitado.

Sinais de alerta num certificado de análise de peptídeo

Alguns padrões surgem em certificados que são reutilizados, editados ou inventados. Considere os seguintes como sinais de alerta:

• Ausência de número de lote, ou um número de lote que não corresponde ao frasco

• Pureza de exatamente 99,0% ou 99,9% em todos os produtos e em todos os lotes

• Ausência de cromatograma ou espetro, apenas um número numa tabela

• Massa molecular observada idêntica ao valor teórico até à quarta casa decimal

• Ausência de data da análise, ou uma data anterior ao prazo de validade indicado

• Imagens desfocadas ou recortadas que ocultam o nome do laboratório

Nenhum destes sinais prova, por si só, que um produto é mau. Em conjunto, devem reduzir a sua confiança. O armazenamento correto após a entrega determina se o lote continua a corresponder ao certificado meses mais tarde, tema que abordamos no nosso guia sobre como armazenar peptídeos.

Perguntas frequentes sobre a leitura de um COA de peptídeo

Fontes

• Roux S, Zékri E, Rousseau B, Paternostre M, Cintrat JC, Fay N. Elimination and exchange of trifluoroacetate counter-ion from cationic peptides: a critical evaluation of different approaches. Journal of Peptide Science. 2008. DOI 10.1002/psc.951

• Cornish J, Callon KE, Lin CQ, Xiao CL, Mulvey TB, Cooper GJ, Reid IR. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 1999. DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779

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