Čistota peptidů vysvětlena: HPLC a hmotnostní spektrometrie

Čistota peptidu je číslo, které každý dodavatel tiskne velkým písmem, a zároveň je to číslo, které je nejčastěji špatně chápáno. Hodnota 98 % pochází z jedné konkrétní metody, reverzní fázové HPLC, a odpovídá na jednu konkrétní otázku. Neříká nic o množství peptidu ve vialce a neprokazuje, že hlavní pík odpovídá správné molekule. Tento průvodce vysvětluje, jak HPLC rozděluje vzorek peptidu, co procento znamená, jaké nečistoty jsou u syntetických peptidů typické a proč je hmotnostní spektrometrie druhou polovinou celkového obrazu.

Jak reverzní fázová HPLC měří čistotu peptidu

HPLC je zkratka pro vysoce účinnou kapalinovou chromatografii. Vzorek se rozpustí a pod vysokým tlakem se prožene kolonou naplněnou drobnými částicemi silikagelu. U reverzní fázové HPLC jsou tyto částice potaženy hydrofobními uhlíkovými řetězci, obvykle C18. Molekuly peptidu se na tento povlak navážou. Kolonou pak protéká směs rozpouštědel, tzv. mobilní fáze. Na začátku je mobilní fáze převážně voda s malým množstvím kyseliny. Během analýzy se postupně zvyšuje podíl organického rozpouštědla, obvykle acetonitrilu. Tomu se říká gradient.

Každá molekula opustí kolonu v tom bodě gradientu, kdy je rozpouštědlo dostatečně silné, aby ji odtrhlo od hydrofobního povlaku. Hydrofilní molekuly se eluují brzy, hydrofobní pozdě. Detektor na konci kolony měří UV absorbanci, obvykle při 214 nebo 220 nm, kde peptidová vazba absorbuje. Výsledkem je chromatogram, tedy křivka s píky, kde každý pík představuje skupinu molekul, které se eluovaly ve stejný čas. Metodu podrobně popisují Mant a kolegové v publikaci Methods in Molecular Biology (2007, DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1).

Hodnota čistoty se vypočítá z ploch píků:

Čistota (%) = plocha hlavního píku / součet všech ploch píků × 100

Co ve skutečnosti znamená čistota peptidu 98 %

Procento má přesný, ale úzký význam. Říká, že 98 % látek absorbujících UV záření, které z kolony vyšly, se objevilo v hlavním píku. Z této definice plyne několik omezení:

• Je relativní, nikoli absolutní. Číslo porovnává píky mezi sebou. Neříká nic o tom, kolik miligramů peptidu je ve vialce.

• Počítá pouze látky absorbující UV záření. Voda, soli a protiionty, například TFA, při 214 nm neabsorbují. Detektor je nevidí a hodnotu čistoty nesnižují.

• Počítá pouze to, co kolona oddělí. Nečistota se stejným retenčním časem jako produkt se skryje uvnitř hlavního píku. Peptid s jedním oxidovaným methioninem se často eluuje velmi blízko mateřského peptidu.

• Závisí na metodě. Delší gradient, jiná kolona nebo jiná vlnová délka mohou u stejného vzorku změnit číslo o jedno až dvě procenta.

Pro většinu laboratorní práce je dostatečná čistota nad 95 %. Pro kvantitativní stanovení nebo cokoli, co vyžaduje známou molární koncentraci, je běžným cílem 98 % a více. Důležitější než samotné číslo je chromatogram, ze kterého vychází. Jak tento dokument číst, popisujeme v článku jak číst certifikát analýzy peptidu (COA).

Typické nečistoty v syntetických peptidech

Výzkumné peptidy se vyrábějí syntézou na pevné fázi. Řetězec se staví po jedné aminokyselině na zrnku pryskyřice. Každý krok má výtěžek přibližně 99 % a chyby se sčítají podle délky řetězce. D'Hondt a kolegové shrnuli třídy nečistot v peptidových produktech v časopise Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis v roce 2014 (DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012). Nejčastější jsou:

• Delečně sekvence: chybí jedna aminokyselina, protože selhal kopulační krok. Peptid je o jeden zbytek kratší a obvykle se eluuje o něco dříve nebo později než úplná sekvence.

• Zkrácené sekvence: řetězec přestal růst předčasně. Jde o podstatně kratší fragmenty.

• Inzerční sekvence: jedna aminokyselina byla přidána dvakrát.

• Neúplně odchráněné peptidy: ze syntézy zůstává připojena ochranná skupina. Jsou hydrofobnější a eluují se pozdě.

• Oxidované a deamidované formy: methionin, cystein a tryptofan oxidují; asparagin a glutamin deamidují. Vznikají během syntézy, štěpení nebo skladování.

• Diastereomery: jedna aminokyselina přešla z L formy do D formy. Tyto látky se velmi špatně oddělují a často se skryjí v hlavním píku.

Dlouhý peptid, jako je CJC-1295, má více kopulačních kroků a více příležitostí k delecím než krátký pentapeptid, jako je Ipamorelin. To je jeden z důvodů, proč se cíle čistoty u jednotlivých produktů liší. Sekvence a délky obou peptidů popisujeme v průvodci CJC-1295 a Ipamorelin. Záleží také na skladování, protože oxidace a deamidace ve vialce pokračují. Jak je zpomalit, vysvětluje náš článek jak skladovat peptidy.

Hmotnostní spektrometrie potvrzuje identitu, nikoli čistotu peptidu

Hmotnostní spektrometrie (MS) ionizuje molekuly ve vzorku a měří jejich poměr hmotnosti a náboje. U peptidů se používá elektrosprejová ionizace (ESI) nebo MALDI. Pokud se naměřená hmotnost shoduje s hmotností vypočtenou ze sekvence, je potvrzena identita hlavní složky.

Je to jiná otázka než čistota. MS ukazuje, že je přítomna molekula s očekávanou hmotností. Neříká, jaký podíl vzorku tato molekula tvoří, a to ze tří důvodů:

• Různé molekuly se ionizují s různou účinností. Malá nečistota, která se dobře ionizuje, může dát velký pík, zatímco produkt může dát pík malý.

• Jeden peptid se objevuje při několika hmotnostech, protože může nést jeden, dva, tři nebo více protonů. Spektrum tedy není jednoduchým počtem.

• Nečistoty se stejnou hmotností jako produkt, například diastereomery, dávají stejný signál a jsou neviditelné.

Platí i opak. HPLC může ukázat jeden čistý pík pro molekulu, která není zamýšleným peptidem. Delece, které chybí jeden glycin, může na chromatogramu vypadat dokonale. Chybějících 57 Da odhalí až hmotnost. Proto úplná analýza kombinuje obě metody a nejlepší certifikáty pocházejí z LC-MS, kde kolona HPLC přivádí eluát přímo do hmotnostního spektrometru a každý pík má vlastní hmotnost.

Proč čistota peptidu není obsah čistého peptidu

Vialka označená 10 mg při čistotě 98 % neobsahuje 9,8 mg peptidu. Hodnota čistoty se vztahuje pouze na peptidovou frakci. Prášek ve vialce obsahuje také vodu, protiionty a někdy soli, které detektor HPLC nevidí. Obsah čistého peptidu je podíl peptidu na celkové hmotnosti. U typické lyofilizované TFA soli leží mezi 70 a 85 %. Úplný výpočet vypadá takto:

Skutečné množství peptidu (mg) = hmotnost na štítku (mg) × obsah čistého peptidu (%) × čistota (%)

Příklad: 10 mg × 0,80 × 0,98 = 7,84 mg správné sekvence. Pokud plánujete koncentraci pro experiment, je to číslo, které použijte. Postup výpočtu je vysvětlen v našem článku jak rekonstituovat peptidy. Dodavatelé, kteří plní podle hmotnosti čistého peptidu, jak je uvedeno v naší kolekci laboratorně testovaných peptidů, to uvádějí na certifikátu.

Časté otázky o čistotě peptidu

Zdroje

• Mant CT, Chen Y, Yan Z, Popa TV, Kovacs JM, Mills JB, Tripet BP, Hodges RS. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology. 2007. DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1

• D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012

Tento článek popisuje laboratorní manipulaci s výzkumnými látkami. Všechny produkty na tomto webu jsou prodávány výhradně pro laboratorní výzkumné použití a nejsou určeny pro lidské ani veterinární použití.