Sterilní technika při rekonstituci peptidů

Sterilní technika při rekonstituci peptidů chrání dvě věci: peptid v lahvičce a validitu vašich výsledků. Rekonstituovaný roztok peptidu se během několika týdnů otevírá opakovaně. Každé propíchnutí zátky je příležitostí pro vstup bakterií, plísňových spor, prachu nebo kožních buněk. Jakmile se dostanou dovnitř, rostou, spotřebovávají peptid a uvolňují enzymy a endotoxiny, které zkreslují jakýkoli test. Tento průvodce popisuje praktický aseptický postup pro výzkumnou laboratoř, potřebný materiál, běžné zdroje kontaminace a standard, který definuje dobrou praxi.

Proč je sterilní technika důležitá při rekonstituci peptidů

Lyofilizované peptidy se expedují v uzavřených lahvičkách, které byly naplněny za kontrolovaných podmínek. Riziko začíná ve chvíli, kdy systém otevřete. Rozpouštědlo přidáváte zátkou, roztok odebíráte zátkou, a obojí děláte na pracovním stole se vzduchem, prachem a povrchy plnými mikroorganismů. Bakteriostatická voda obsahuje 0,9 % benzylalkoholu, který zpomaluje růst bakterií, ale nezabije vše a nic nezmůže proti enzymům, které už v lahvičce jsou.

Austin a Elia zhodnotili publikovaná data o mikrobiální kontaminaci aseptických příprav v časopise Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences v roce 2009 (DOI 10.18433/J3JP4B). Přípravky vyrobené v nekontrolovaném prostředí byly kontaminovány mnohem častěji než ty, které vznikly v laminárním boxu nebo čisté místnosti. O tom, zda lahvička zůstane čistá, rozhoduje prostředí a technika, nikoli rozpouštědlo.

USP 797 jako referenční standard

Americký lékopis (United States Pharmacopeia) publikuje standard pro sterilní přípravky v obecné kapitole USP 797. Je napsán pro lékárny, nikoli pro výzkumné laboratoře, a mnohé jeho požadavky, jako certifikované čisté místnosti a monitorování prostředí, jdou nad rámec toho, co výzkumné prostředí potřebuje. Je však nejlepší referencí, protože popisuje logiku aseptické práce: očistit ruce, očistit povrchy, kontrolovat vzduch, dezinfikovat každé kritické místo, nikdy se nedotýkat ničeho, co přijde do styku s produktem, a omezit dobu, po kterou se příprava uchovává. Oddíly o hygieně rukou, oblékání, dezinfekci kritických míst a datu použitelnosti po přípravě jsou přímo využitelné.

Příprava čistého pracovního prostoru

Ideální je laminární box. Pokud ho nemáte, zvolte pracovní stůl dál od dveří, oken, dřezů a frekventovaného pohybu a vypněte ventilátory, které profukují přes povrch. Poté připravte prostor:

• Uklidněte stůl od všeho, co k úkolu nepotřebujete.

• Otřete povrch 70% isopropylalkoholem a nechte ho uschnout.

• Umyjte si ruce mýdlem alespoň 30 sekund a osušte je čistým papírovým ubrouskem.

• Nasaďte si nové nitrilové rukavice a otřete je alkoholem.

• Svažte vlasy a noste laboratorní plášť s uzavřenými rukávy.

• Než cokoli otevřete, připravte si všechen materiál.

Nemluvte, nekašlete a nenaklánějte se nad otevřený materiál.

Materiál pro sterilní rekonstituci peptidů

Vše, co přijde do styku s rozpouštědlem nebo roztokem, musí být sterilní a použito jednou. Seznam je krátký:

• Sterilní jednorázové stříkačky o objemu odpovídajícím přípravě, například 1 ml nebo 3 ml. Obal otevírejte až bezprostředně před použitím.

• Sterilní jednorázové jehly, jednu pro nabírání rozpouštědla a novou pro každý další odběr. Jehla, která byla použita jednou, už není sterilní.

• Sterilní alkoholové tampony, jednotlivě balené.

• Bakteriostatická voda ve vzduchotěsně uzavřené vícedávkové lahvičce, například naše bakteriostatická voda 10 ml. Kompletní nabídku rozpouštědel a spotřebního materiálu najdete v kolekci bakteriostatická voda a laboratorní potřeby.

• Sterilní stříkačkový filtr 0,22 µm, volitelný, pro roztoky, které se použijí v buněčné kultuře nebo se budou delší dobu skladovat.

• Štítky, permanentní fix a nádobu na ostrý odpad.

Stříkačku nikdy nepoužívejte znovu, a to ani pro stejnou lahvičku ve stejný den. Nikdy se nedotýkejte dříku jehly, špičky stříkačky ani vnitřku víčka. Tyto povrchy se nazývají kritická místa a smějí přijít do styku pouze se sterilním materiálem.

Postup sterilní techniky krok za krokem při rekonstituci peptidů

Základní postup rekonstituce, včetně výpočtu koncentrace, vysvětluje náš průvodce jak rekonstituovat peptidy. Následující kroky k tomuto postupu přidávají aseptickou disciplínu:

1. Nechte lahvičku s peptidem ohřát na pokojovou teplotu v uzavřené krabičce. Otevření studené lahvičky přitáhne do prášku vlhkost ze vzduchu.

2. Odstraňte odklápěcí víčka z obou lahviček. Gumová zátka pod nimi není zvenku sterilní.

3. Otřete každou zátku novým alkoholovým tamponem a nechte alkohol zcela uschnout. Trvá to asi 30 sekund.

4. Otevřete stříkačku a nasaďte jehlu, aniž byste se dotkli špičky nebo hrdla jehly.

5. Nabeerte do stříkačky vzduch v objemu rovném objemu rozpouštědla, zapíchněte jehlu skrz zátku rozpouštědla a vzduch vtlačte dovnitř. Tím se vyrovnají tlaky.

6. Nabeerte rozpouštědlo pomalu a odstraňte bublinky vzduchu, dokud je jehla stále ve lahvičce.

7. Zapíchněte jehlu do lahvičky s peptidem pod úhlem, se šikmým řezem směřujícím ke sklu, a nechte rozpouštědlo stékat po vnitřní stěně. Nestříkejte ho na prášek.

8. Vytáhněte jehlu a okamžitě ji zlikvidujte v nádobě na ostrý odpad.

9. Lahvičkou jemně zakružte, dokud se prášek nerozpustí. Netřepte.

10. Znovu otřete zátku, než lahvičku uložíte, a pokud máte, nasaďte na ni nové víčko nebo sterilní kryt.

Při každém dalším odběru opakujte sled: otření, osušení, nová jehla a stříkačka, odběr, likvidace, otření, uložení.

Filtrace roztoku

Stříkačkový filtr 0,22 µm odstraní bakterie a plísňové spory, nikoli však viry ani endotoxiny. Filtrace je užitečná, pokud roztok půjde do buněčné kultury nebo bude uložen déle než několik týdnů. Nabeerte celý roztok do sterilní stříkačky, nasaďte filtr a roztok pomalu vytlačte do nové sterilní lahvičky. Peptidy se mohou vázat na membrány filtrů, proto použijte filtr s nízkou vazbou bílkovin, například PVDF nebo PES, a počítejte s mírnou ztrátou materiálu. U roztoků, které použijete během krátké doby, filtrace není nutná.

Označování a dokumentace

Lahvička bez štítku je lahvička, kterou nemůžete použít. Na každou rekonstituovanou lahvičku napište:

• Název peptidu a číslo šarže z certifikátu o analýze

• Použité rozpouštědlo a celkový přidaný objem

• Výslednou koncentraci v mg/ml

• Datum a čas rekonstituce

• Vaše iniciály

Stejné údaje zaznamenejte do laboratorního deníku. USP 797 nazývá omezení doby skladování datem použitelnosti po přípravě. U výzkumné lahvičky v bakteriostatické vodě skladované při 2 až 8 °C si mnoho laboratoří stanoví čtyři týdny. Podmínkám skladování po rekonstituci se věnuje náš průvodce jak skladovat peptidy.

Běžné zdroje kontaminace

Většinu kontaminovaných lahviček lze vysledovat k několika chybám:

• Zapíchnutí jehly dříve, než alkohol na zátce uschne

• Dotyk jehly nebo špičky stříkačky prstem nebo o pracovní stůl

• Opětovné použití stříkačky nebo jehly pro druhý odběr

• Ponechání lahvičky bez víčka na stole

• Použití lahvičky s rozpouštědlem, která je otevřená už několik měsíců

Zakalený roztok, viditelné částice nebo blána na povrchu jsou známky kontaminace. Takovou lahvičku nepoužívejte. Zlikvidujte ji a rekonstituujte novou. Produkty z naší nabídky laboratorně testovaných peptidů přicházejí s certifikátem, který dokládá čistotu šarže v době testování. Sterilní technika udrží roztok na této kvalitě i poté, co ho otevřete.

Často kladené otázky o sterilní technice při práci s peptidy

Zdroje

• United States Pharmacopeia. General Chapter 797: Pharmaceutical Compounding, Sterile Preparations. usp.org/compounding/general-chapter-797

• Austin PD, Elia M. A systematic review and meta-analysis of the risk of microbial contamination of aseptically prepared doses in different environments. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2009. DOI 10.18433/J3JP4B

Tento článek popisuje laboratorní manipulaci s výzkumnými látkami. Všechny produkty na těchto stránkách se prodávají pouze pro laboratorní výzkumné účely a nejsou určeny k lidskému ani veterinárnímu použití.