Jak skladovat peptidy: lyofilizovaný prášek a rekonstituované roztoky

Jak skladujete peptidy, určuje, jak dlouho zůstanou v laboratoři použitelné. Peptid je řetězec aminokyselin a tento řetězec je citlivý na teplo, vodu, světlo a kyslík. Uzavřená lahvička lyofilizovaného prášku může být za správných podmínek stabilní po řadu let. Stejný peptid v roztoku může ztratit kvalitu během několika týdnů. Tento průvodce popisuje podmínky skladování obou forem, typickou dobu použitelnosti, co se děje během přepravy a jak poznáte degradovaný peptid.

Proč je třeba peptidy skladovat pečlivě

Peptidy se rozkládají prostřednictvím malého počtu chemických reakcí. Nejdůležitější jsou hydrolýza (řetězec je štěpen vodou), oxidace (především methioninu, cysteinu a tryptofanu), deamidace (asparagin a glutamin ztrácejí amidovou skupinu) a agregace (molekuly peptidů se k sobě lepí). Manning, Patel a Borchardt tyto dráhy popsali v přehledu v časopise Pharmaceutical Research v roce 1989 (DOI 10.1023/A:1015929109894). Každá reakce probíhá rychleji při vyšší teplotě a za přítomnosti vody. Nízká teplota a suchý stav zpomalují všechny tyto reakce současně.

Proto se výzkumné peptidy expedují jako mrazem sušený prášek. Voda byla odstraněna, takže hydrolýza a růst mikroorganismů prakticky ustanou. Lai a Topp ukázali v časopise Journal of Pharmaceutical Sciences v roce 1999, že peptidy a proteiny v pevném stavu se stále pomalu rozkládají a že hlavním faktorem, který tuto rychlost řídí, je zbytková vlhkost (DOI 10.1021/js980374e). Suché skladování proto není volitelné. Je to nejúčinnější opatření, které můžete udělat.

Jak skladovat peptidy ve formě lyofilizovaného prášku

Uzavřená lahvička lyofilizovaného peptidu je nejstabilnější formou, se kterou budete pracovat. Následující podmínky jsou v laboratořích pracujících s peptidy standardem:

• Dlouhodobé skladování: -20 °C v mrazáku bez automatického odmrazování. Mnoho laboratoří používá -80 °C u peptidů obsahujících cystein, methionin nebo tryptofan.

• Krátkodobé skladování: 2 až 8 °C v chladničce je přijatelné po dobu několika týdnů, například u lahvičky, kterou brzy rekonstituujete.

• Světlo: lahvičku uchovávejte v krabičce nebo v neprůhledné nádobě. Tryptofan a tyrosin absorbují UV záření a mohou oxidovat.

• Vlhkost: lahvičku uchovávejte uzavřenou až do použití. Pokud má váš mrazák vysokou vlhkost, uložte ji s vysoušecím sáčkem.

Lyofilizovaný prášek je hygroskopický. Přitahuje vodu ze vzduchu. Pokud otevřete studenou lahvičku, vlhkost z pokojového vzduchu zkondenzuje na prášku během několika sekund. Vždy nechte lahvičku ohřát na pokojovou teplotu, než sejmete víčko. U standardní lahvičky o objemu 3 ml to trvá zhruba 15 až 20 minut.

Jak skladovat peptidy po rekonstituci

Jakmile prášek rozpustíte, je peptid v kontaktu s vodou a začínají degradační reakce. Záleží na tom, jaké rozpouštědlo zvolíte. Bakteriostatická voda obsahuje 0,9 % benzylalkoholu, který brání růstu bakterií v lahvičce, která se otevírá opakovaně. Chemickou degradaci však nezastaví. Celý postup si můžete přečíst v našem průvodci jak rekonstituovat peptidy a rozpouštědlo najdete v kolekci bakteriostatická voda a laboratorní potřeby.

Pro rekonstituovaný roztok platí tato pravidla:

• Lahvičku skladujte v chladničce při 2 až 8 °C, nikdy při pokojové teplotě.

• Lahvičku držte svisle, aby roztok dlouho nebyl v kontaktu s gumovou zátkou.

• Roztok chraňte před světlem. Stačí malá kartonová krabička v lednici.

• Na štítek napište název peptidu, koncentraci a datum rekonstituce.

• Roztok plánujte použít během několika týdnů. Mnoho peptidů v bakteriostatické vodě se běžně používá do přibližně čtyř týdnů při 2 až 8 °C. Některé jsou citlivější, proto si ověřte konkrétní peptid.

Cykly zmrazování a rozmrazování a rozdělování na alikvóty

Roztok lze zmrazit, ale každý cyklus zmrazení a rozmrazení peptid zatěžuje. Při zmrazování vznikají ledové krystaly a peptid se koncentruje v malých kapsách kapaliny mezi nimi. To lokálně mění pH a koncentraci solí a podporuje agregaci. Při rozmrazování se děje opak. Jeden cyklus je obvykle přijatelný. Pět cyklů už přijatelných není.

Řešením je rozdělení na alikvóty. Rekonstituovaný peptid rozdělte do malých porcí odpovídajících objemu potřebnému pro jeden experiment. Alikvóty zmrazte jednou při -20 °C nebo níže. Když ji potřebujete, rozmrazte jeden alikvót a zbytek zlikvidujte. Tato metoda zabrání tomu, aby se hlavní zásoba opakovaně ohřívala a ochlazovala. Používejte sterilní zkumavky s nízkou adsorpcí, protože peptidy se mohou vázat na plastové povrchy. Označte každou zkumavku, nejen krabičku.

Typická doba použitelnosti při správném skladování peptidů

Přesná doba použitelnosti závisí na sekvenci. Peptidy obsahující cystein, methionin, tryptofan, asparagin nebo glutamin se rozkládají rychleji. Krátké, jednoduché sekvence vydrží déle. Následující hodnoty jsou orientační pokyny pro výzkumné peptidy a nejsou zárukou:

• Lyofilizovaný, uzavřený, -20 °C: několik let

• Lyofilizovaný, uzavřený, 2 až 8 °C: měsíce až přibližně jeden rok

• Lyofilizovaný, pokojová teplota: týdny, vhodné pouze pro přepravu

• Rekonstituovaný v bakteriostatické vodě, 2 až 8 °C: přibližně čtyři týdny u mnoha peptidů

• Rekonstituovaný, jednou zmrazený jako alikvóty: několik měsíců

Peptid jako BPC-157 je ve formě prášku poměrně odolný. Měděný komplex jako GHK-Cu je rovněž stabilní v podobě prášku, ale po rekonstituci by měl být chráněn před světlem. Certifikát analýzy udává čistotu v den testování, nikoli v den použití. Jak tento dokument číst, vysvětluje náš článek jak číst certifikát analýzy peptidu.

Stabilita při přepravě

Mnoho výzkumníků se ptá, zda peptid přežije několik dní v poště bez chlazení. U lyofilizovaného prášku v uzavřené lahvičce je odpověď obvykle ano. Suchý stav zpomaluje degradaci natolik, že několikadenní přeprava při pokojové teplotě má na čistotu velmi malý vliv. Proto dodavatelé prášky zpravidla posílají bez chladicích vložek. Lahvičky uložte do mrazáku nebo chladničky v den, kdy zásilka dorazí. Balík nenechávejte v teplé místnosti, v autě ani na přímém slunci.

Rekonstituované roztoky by se neměly přepravovat. Pokud musíte roztok převézt mezi laboratořemi, použijte izolovaný box s chladicími vložkami a udržujte dobu přepravy krátkou.

Známky degradace

Většinu chemické degradace pouhým okem nepoznáte. Oxidace a deamidace mění molekulu, ale ne vzhled prášku. Přesto několik viditelných znaků by vás mělo zastavit a zkontrolovat:

• Prášek se změnil na lepivý film nebo skelnatou kapku na dně lahvičky. To ukazuje na příjem vlhkosti.

• Prášek změnil barvu, například z bílé na žlutou.

• Rekonstituovaný roztok je zakalený, obsahuje částice nebo vytvořil gel. To ukazuje na agregaci nebo kontaminaci.

• Roztok se ani po jemném protřepání úplně nerozpustí.

• Těsnění lahvičky bylo porušeno nebo je zátka uvolněná.

Pokud pozorujete kterýkoli z těchto znaků, nepoužívejte lahvičku pro experiment, který závisí na známé koncentraci. Tam, kde na tom záleží, ověřte čistotu pomocí HPLC. Náš článek čistota peptidů, HPLC a hmotnostní spektrometrie vysvětluje, co takový test ukazuje.

Často kladené otázky o skladování peptidů

Zdroje

• Manning MC, Patel K, Borchardt RT. Stability of protein pharmaceuticals. Pharmaceutical Research. 1989. DOI 10.1023/A:1015929109894

• Lai MC, Topp EM. Solid-state chemical stability of proteins and peptides. Journal of Pharmaceutical Sciences. 1999. DOI 10.1021/js980374e

Tento článek popisuje laboratorní manipulaci s výzkumnými látkami. Všechny produkty na tomto webu jsou prodávány výhradně pro laboratorní výzkum a nejsou určeny k použití u lidí nebo zvířat.