Jak číst certifikát analýzy peptidu (COA)

Certifikát analýzy peptidu (COA) je dokument, který vám říká, co je skutečně uvnitř lahvičky. Uvádí testy, které laboratoř provedla na konkrétní šarži, a jejich výsledky. COA je jediný objektivní důkaz, že prášek odpovídá štítku. Tento průvodce vysvětluje, co dobrý COA obsahuje, jak interpretovat jednotlivé hodnoty, jaký je rozdíl mezi čistotou a čistým obsahem peptidu a které znaky ukazují na dokument, kterému byste neměli věřit.

Co certifikát analýzy peptidu obsahuje

COA je vždy vázán na jednu šarži, která se také nazývá lot. Různé šarže stejného peptidu mají různé výsledky, proto dokument musí uvádět číslo šarže, které je vytištěno na vaší lahvičce. Kompletní COA pro výzkumný peptid obvykle obsahuje následující položky:

• Název produktu a sekvence: aminokyselinová sekvence, nebo alespoň název a molekulární vzorec

• Číslo šarže nebo lotu: musí odpovídat štítku na lahvičce

• Teoretická a naměřená molekulová hmotnost: z hmotnostní spektrometrie

• Čistota: z reverzní fázové HPLC, uvedená v procentech

• Vzhled: obvykle bílý lyofilizovaný prášek

• Protiion: trifluoracetát (TFA), nebo acetát

• Obsah vody a čistý obsah peptidu: pokud byl stanoven

• Endotoxin nebo bioburden: na některých certifikátech

• Datum analýzy a název testovací laboratoře

COA s identitou a čistotou je minimum. COA s čistým obsahem a protiiontem je lepší, protože tyto hodnoty mění způsob, jakým počítáte koncentrace, když rozpouštíte peptidy.

Identita pomocí hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie (MS) měří hmotnost molekuly. COA uvádí teoretickou molekulovou hmotnost, vypočtenou ze sekvence, a naměřenou molekulovou hmotnost, změřenou přístrojem. Obě hodnoty by se měly shodovat v rámci tolerance metody. U ESI-MS na malém peptidu je rozdíl menší než 1 Da běžný. Větší rozdíl znamená, že molekula nese modifikaci, například navíc atom kyslíku, nebo chybí aminokyselina.

Mnohé certifikáty zobrazují surové spektrum s několika píky. To je očekávané. Peptid s molekulovou hmotností 1419 Da se objeví při 1420 (jednou nabitý, [M+H]+), při 710,5 (dvakrát nabitý) a při 474 (třikrát nabitý). Jde o stejnou molekulu s různým počtem navázaných protonů.

MS potvrzuje, o jakou molekulu jde. Neříká vám, kolik vzorku tvoří tato molekula. To je úkol HPLC, které se věnujeme v článku o čistotě peptidů, HPLC a hmotnostní spektrometrii.

Čistota pomocí HPLC na certifikátu analýzy peptidu

Reverzní fázová HPLC rozdělí vzorek na jeho složky a detekuje je pomocí UV absorbance, obvykle při 214 nebo 220 nm. Výsledkem je chromatogram s píky. Hodnota čistoty na COA je plocha hlavního píku dělená celkovou plochou všech píků. Čistota 98,5 % znamená, že 98,5 % materiálu absorbujícího UV záření vyeluovalo jako hlavní produkt. Zkontrolujte tři věci:

• Vlnová délka. 214 nm detekuje peptidovou vazbu a zachytí téměř všechny nečistoty. 280 nm detekuje pouze tryptofan a tyrosin a může nečistoty skrýt. Čistota měřená při 280 nm je méně vypovídající.

• Samotný chromatogram. Dobrý COA zobrazuje průběh měření. Ostrý hlavní pík a rovná základní linie je obraz, který chcete vidět. Několik píků blízko hlavního píku ukazuje na delece sekvence nebo oxidované formy.

• Metoda. Kolona, gradient a délka analýzy by měly být uvedeny. Velmi krátká analýza může sloučit nečistoty s hlavním píkem a čistotu zdánlivě zvýšit.

Čistý obsah peptidu versus čistota

Právě tady se většina čtenářů spletе. Čistota vám říká, jaký podíl peptidového materiálu tvoří správná sekvence. Čistý obsah peptidu vám říká, jaký podíl celkové hmotnosti prášku je vůbec peptid. Tato dvě čísla jsou nezávislá.

Lyofilizovaný peptidový prášek nikdy není ze 100 % peptid. Obsahuje také vázanou vodu, protiionty a někdy zbytkové soli. Typický syntetický peptid s čistotou 98 % může mít čistý obsah peptidu 70 až 85 %. Pokud je lahvička označena 10 mg a čistý obsah je 80 %, lahvička obsahuje 8 mg peptidu. Pokud potřebujete přesnou koncentraci, počítejte s čistým obsahem, ne s hmotností uvedenou na štítku. Čistý obsah se obvykle stanovuje analýzou aminokyselin nebo dusíku. Pokud COA tuto hodnotu neuvádí, předpokládejte, že štítek ukazuje hrubou hmotnost.

Protiionty: TFA a acetát

Peptidy se čistí pomocí HPLC s kyselinou v mobilní fázi. Nejběžnější kyselinou je kyselina trifluoroctová (TFA). Po čištění zůstává TFA navázána na bazické skupiny peptidu jako protiion. Peptid s několika bazickými zbytky může nést 10 až 20 % své hmotnosti jako sůl TFA. Roux a kolegové v roce 2008 v časopise Journal of Peptide Science přezkoumali metody odstranění nebo výměny TFA (DOI 10.1002/psc.951). Běžnou alternativou je acetát. Jeho výměna probíhá v dalším kroku a je dražší.

Protiion je důležitý ze dvou důvodů. Zaprvé mění čistý obsah peptidu, a tedy skutečné množství v lahvičce. Zadruhé TFA není inertní v buněčných testech. Cornish a kolegové ukázali v roce 1999 v American Journal of Physiology, že trifluoracetát zbylý po čištění měnil růst kultivovaných osteoblastů a chondrocytů (DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779). Pro práci s buněčnými kulturami je lepší zvolit acetátovou sůl nebo krok k odstranění TFA. COA, který neuvádí protiion, vás nechává v nejistotě.

Obsah vody, endotoxin a další testy

Obsah vody se měří Karl Fischerovou titrací a u lyofilizovaného peptidu se obvykle pohybuje mezi 3 a 10 %. Promítá se do čistého obsahu. Endotoxin se testuje metodou LAL a uvádí se v endotoxinových jednotkách na miligram. Tento test je důležitý pro buněčné testy, kde by bakteriální kontaminanty výsledek zkreslily. Zbytková rozpouštědla, jako acetonitril, se objevují na certifikátech farmaceutické kvality, ale na výzkumných certifikátech jen zřídka.

Testování třetí stranou versus interní testování

COA může pocházet od výrobce, od prodejce nebo od nezávislé laboratoře. Interní testování není špatné, ale představuje střet zájmů. Silnějším důkazem je COA od třetí strany z pojmenované, akreditované laboratoře s vlastním číslem zprávy. Nejlepší je dodavatel, který zveřejňuje obojí: certifikát výrobce a nezávislé opakované měření stejné šarže. Kolekce laboratorně testovaných peptidů uvádí produkty, u kterých je dostupné testování šarží, například BPC-157 10 mg. Ověřte, že laboratoř existuje a že číslo šarže odpovídá vaší lahvičce. Renomovaná testovací laboratoř číslo zprávy na vyžádání potvrdí.

Varovné signály na certifikátu analýzy peptidu

Některé vzorce se objevují na certifikátech, které jsou opakovaně použité, upravené nebo vymyšlené. Za varovné signály považujte následující:

• Chybí číslo šarže, nebo číslo šarže neodpovídá lahvičce

• Čistota přesně 99,0 % nebo 99,9 % u každého produktu a každé šarže

• Chybí chromatogram nebo spektrum, je tam jen číslo v tabulce

• Naměřená molekulová hmotnost je shodná s teoretickou hodnotou na čtyři desetinná místa

• Chybí datum analýzy, nebo je datum starší, než uvedená doba použitelnosti

• Rozmazané nebo oříznuté obrázky, které skrývají název laboratoře

Žádný z těchto znaků sám o sobě neprokazuje, že produkt je špatný. Společně by ale měly snížit vaši důvěru. Správné skladování po doručení rozhoduje o tom, zda šarže po měsících stále odpovídá certifikátu, o čemž pojednáme v průvodci jak skladovat peptidy.

Často kladené otázky ke čtení COA peptidu

Zdroje

• Roux S, Zékri E, Rousseau B, Paternostre M, Cintrat JC, Fay N. Elimination and exchange of trifluoroacetate counter-ion from cationic peptides: a critical evaluation of different approaches. Journal of Peptide Science. 2008. DOI 10.1002/psc.951

• Cornish J, Callon KE, Lin CQ, Xiao CL, Mulvey TB, Cooper GJ, Reid IR. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 1999. DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779

Tento článek popisuje laboratorní manipulaci s výzkumnými látkami. Všechny produkty na tomto webu se prodávají pouze pro laboratorní výzkum a nejsou určeny k použití u lidí ani zvířat.