Peptidrenhet förklarad: HPLC och masspektrometri

Peptidrenhet är siffran som varje leverantör skriver ut med stor stil, och det är också siffran som oftast missförstås. Ett värde som 98 % kommer från en specifik metod, omvänd-fas-HPLC, och svarar på en specifik fråga. Den berättar inte mängden peptid i injektionsflaskan, och den bevisar inte att huvudtoppen är rätt molekyl. Den här guiden förklarar hur HPLC separerar ett peptidprov, vad procenttalet betyder, vilka föroreningar som är typiska för syntetiska peptider och varför masspektrometri är den andra halvan av bilden.

Så mäter omvänd-fas-HPLC peptidrenhet

HPLC står för högpresterande vätskekromatografi. Provet löses upp och pumpas under högt tryck genom en kolonn fylld med små kiseldioxidpartiklar. Vid omvänd-fas-HPLC är dessa partiklar belagda med hydrofoba kolkedjor, vanligtvis C18. Peptidmolekylerna fastnar i denna beläggning. En lösningsmedelsblandning, den mobila fasen, flödar sedan genom kolonnen. I början består den mobila fasen mest av vatten med lite syra. Under körningen ökas andelen organiskt lösningsmedel, vanligtvis acetonitril, steg för steg. Detta kallas en gradient.

Varje molekyl lämnar kolonnen vid den punkt i gradienten där lösningsmedlet är tillräckligt starkt för att dra loss den från den hydrofoba beläggningen. Hydrofila molekyler eluerar tidigt. Hydrofoba molekyler eluerar sent. En detektor i kolonnens slut mäter UV-absorbans, vanligtvis vid 214 eller 220 nm, där peptidbindningen absorberar. Resultatet är ett kromatogram: en linje med toppar, där varje topp är en grupp molekyler som eluerade samtidigt. Mant med flera beskriver metoden i detalj i Methods in Molecular Biology (2007, DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1).

Renhetsvärdet beräknas från toppareorna:

Renhet (%) = area för huvudtoppen / summan av alla toppareor × 100

Vad 98 % peptidrenhet faktiskt betyder

Procenttalet har en exakt men snäv betydelse. Det säger att 98 % av det UV-absorberande materialet som eluerade från kolonnen kom ut i huvudtoppen. Fyra begränsningar följer av denna definition:

• Den är relativ, inte absolut. Siffran jämför toppar med varandra. Den säger ingenting om hur många milligram peptid som finns i injektionsflaskan.

• Den räknar bara det som absorberar UV. Vatten, salter och motjoner som TFA absorberar inte vid 214 nm. De är osynliga för detektorn och sänker inte renhetsvärdet.

• Den räknar bara det som kolonnen separerar. En förorening med samma retentionstid som produkten gömmer sig inuti huvudtoppen. En peptid med en oxiderad metionin eluerar ofta mycket nära moderpeptiden.

• Den beror på metoden. En längre gradient, en annan kolonn eller en annan våglängd kan ändra siffran med en eller två procent för samma prov.

För de flesta laboratoriearbeten räcker en renhet över 95 %. För kvantitativa analyser eller allt som kräver en känd molär koncentration är 98 % eller högre det vanliga målet. Viktigare än siffran är kromatogrammet bakom den. Hur man läser dokumentet behandlas i vår artikel om hur man läser ett analyscertifikat för peptider.

Typiska föroreningar i syntetiska peptider

Forskningspeptider tillverkas genom fastfaspeptidsyntes. Kedjan byggs upp en aminosyra i taget på en hartspärla. Varje steg har ett utbyte på cirka 99 %, och felen adderas över kedjans längd. D'Hondt och medarbetare granskade föroreningsklasserna i peptidläkemedel i Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2014 (DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012). De vanligaste är:

• Deletionssekvenser: en aminosyra saknas eftersom ett kopplingssteg misslyckades. Peptiden är en rest kortare och eluerar vanligtvis något tidigare eller senare än den fullständiga sekvensen.

• Trunkerade sekvenser: kedjan slutade växa för tidigt. Dessa är betydligt kortare fragment.

• Insertionssekvenser: en aminosyra har lagts till två gånger.

• Ofullständigt avskyddade peptider: en skyddsgrupp från syntesen sitter fortfarande kvar. Dessa är mer hydrofoba och eluerar sent.

• Oxiderade och deamiderade former: metionin, cystein och tryptofan oxideras; asparagin och glutamin deamideras. Dessa bildas vid syntes, klyvning eller lagring.

• Diastereomerer: en aminosyra har vänt från L-formen till D-formen. Dessa är mycket svåra att separera och gömmer sig ofta i huvudtoppen.

En lång peptid som CJC-1295 har fler kopplingssteg och fler möjligheter till deletioner än en kort pentapeptid som Ipamorelin. Det är en anledning till att renhetsmålen skiljer sig mellan produkter. Sekvenserna och längderna för båda beskrivs i vår guide om CJC-1295 och Ipamorelin. Förvaring spelar också roll, eftersom oxidation och deamidering fortsätter i injektionsflaskan. Vår guide om hur man förvarar peptider förklarar hur man bromsar detta.

Masspektrometri bekräftar identitet, inte peptidrenhet

Masspektrometri (MS) joniserar molekylerna i ett prov och mäter deras massa-laddningsförhållande. För peptider används elektrosprayjonisering (ESI) eller MALDI. Om den uppmätta massan stämmer med massan beräknad från sekvensen bekräftas identiteten hos huvudkomponenten.

Det här är en annan fråga än renhet. MS visar att molekylen med den förväntade massan finns. Den visar inte hur stor andel av provet den molekylen utgör, av tre skäl:

• Olika molekyler joniseras med olika effektivitet. En liten förorening som joniseras väl kan ge en stor topp, medan produkten kan ge en liten.

• En enskild peptid syns vid flera massor eftersom den kan bära en, två, tre eller fler protoner. Spektrumet är inte en enkel räkning.

• Föroreningar med samma massa som produkten, till exempel diastereomerer, ger samma signal och är osynliga.

Det omvända gäller också. HPLC kan visa en enda ren topp för en molekyl som inte är den avsedda peptiden. En deletionssekvens som saknar en glycin kan se perfekt ut i ett kromatogram. Endast massan avslöjar de saknade 57 Da. Därför kombinerar en fullständig analys båda metoderna, och de bästa certifikaten kommer från LC-MS, där HPLC-kolonnen matar masspektrometern direkt och varje topp får sin egen massa.

Varför peptidrenhet inte är nettopeptidinnehåll

En injektionsflaska märkt 10 mg med 98 % renhet innehåller inte 9,8 mg peptid. Renhetsvärdet gäller endast peptidfraktionen. Pulvret i flaskan innehåller också vatten, motjoner och ibland salter, som ingen av dem HPLC-detektorn ser. Nettopeptidinnehållet är andelen av totalmassan som är peptid. För ett typiskt lyofiliserat TFA-salt ligger det mellan 70 och 85 %. Hela beräkningen ser ut så här:

Faktisk peptid (mg) = märkvikt (mg) × nettopeptidinnehåll (%) × renhet (%)

Exempel: 10 mg × 0,80 × 0,98 = 7,84 mg av rätt sekvens. Om du planerar en koncentration för ett experiment är detta siffran att använda. Metoden för beräkningen förklaras i vår guide om hur man rekonstituerar peptider. Leverantörer som fyller efter nettopeptidvikt, som listas i vår samling laboratorietestade peptider, anger detta på certifikatet.

Vanliga frågor om peptidrenhet

Källor

• Mant CT, Chen Y, Yan Z, Popa TV, Kovacs JM, Mills JB, Tripet BP, Hodges RS. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology. 2007. DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1

• D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012

Den här artikeln beskriver laboratoriehantering av forskningsämnen. Alla produkter på den här sajten säljs endast för laboratorieforskning och är inte avsedda för användning på människor eller djur.