Så läser du ett peptidcertifikat för analys (COA)

Ett peptidcertifikat för analys (COA) är dokumentet som visar vad som faktiskt finns i en injektionsflaska. Det listar de tester som ett laboratorium utfört på en specifik batch och resultaten av dessa tester. Ett COA är det enda objektiva beviset på att pulvret stämmer överens med etiketten. Den här guiden förklarar vad ett bra COA innehåller, hur du tolkar varje värde, skillnaden mellan renhet och nettopeptidinnehåll samt vilka tecken som pekar på ett dokument du inte bör lita på.

Vad ett peptidcertifikat för analys innehåller

Ett COA är alltid kopplat till en batch, även kallad lot. Olika batcher av samma peptid ger olika resultat, så dokumentet måste ange det batchnummer som är tryckt på din injektionsflaska. Ett komplett COA för en forskningspeptid visar vanligtvis följande punkter:

• Produktnamn och sekvens: aminosyrasekvensen eller åtminstone namnet och den molekylära formeln

• Batch- eller lotnummer: måste stämma överens med etiketten på flaskan

• Teoretisk och observerad molekylvikt: från masspektrometri

• Renhet: från omvänd-fas-HPLC, angiven i procent

• Utseende: vanligtvis vitt frystorkat pulver

• Motjon: trifluoracetat (TFA) eller acetat

• Vatteninnehåll och nettopeptidinnehåll: om det har bestämts

• Endotoxin eller bioburden: på vissa certifikat

• Analysdatum och namn på testlaboratoriet

Ett COA med identitet och renhet är miniminivån. Ett COA med nettoinnehåll och motjon är bättre, eftersom dessa värden påverkar hur du beräknar koncentrationer när du rekonstituerar peptider.

Identitet genom masspektrometri

Masspektrometri (MS) mäter molekylens massa. COA:t anger en teoretisk molekylvikt, beräknad från sekvensen, och en observerad molekylvikt, uppmätt av instrumentet. De två värdena bör stämma överens inom metodens tolerans. För ESI-MS på en liten peptid är en skillnad på mindre än 1 Da normalt. En större skillnad betyder att molekylen har en modifiering, till exempel en extra syreatom eller en saknad aminosyra.

Många certifikat visar det råa spektrumet med flera toppar. Detta är väntat. En peptid med molekylvikten 1419 Da syns vid 1420 (enkelt laddad, [M+H]+), vid 710,5 (dubbelt laddad) och vid 474 (trippelt laddad). Det är samma molekyl med olika antal protoner bundna.

MS bekräftar vad molekylen är. Den säger inte hur stor del av provet som utgörs av just den molekylen. Det är HPLC:s uppgift, som vi förklarar i vår artikel om peptidrenhet, HPLC och masspektrometri.

Renhet med HPLC på ett peptidcertifikat för analys

Omvänd-fas-HPLC separerar provet i dess beståndsdelar och detekterar dem med UV-absorbans, vanligtvis vid 214 eller 220 nm. Resultatet är ett kromatogram med toppar. Renhetsvärdet på COA:t är arean av huvudtoppen dividerad med den totala arean av alla toppar. En renhet på 98,5 % betyder att 98,5 % av det UV-absorberande materialet eluerades som huvudprodukten. Kontrollera tre saker:

• Våglängden. 214 nm detekterar peptidbindningen och ser nästan alla föroreningar. 280 nm detekterar endast tryptofan och tyrosin och kan dölja föroreningar. En renhet mätt vid 280 nm är mindre informativ.

• Själva kromatogrammet. Ett bra COA visar kurvan. En skarp huvudtopp och en plan baslinje är bilden du vill se. Flera toppar nära huvudtoppen pekar på deletionssekvenser eller oxiderade former.

• Metoden. Kolonn, gradient och körtid bör anges. En mycket kort körning kan slå ihop föroreningar med huvudtoppen och få renheten att se bättre ut än den är.

Nettopeptidinnehåll kontra renhet

Här är det de flesta läsare misstolkar. Renhet säger vilken andel av peptidmaterialet som har rätt sekvens. Nettopeptidinnehåll säger vilken andel av den totala pulvermassan som över huvud taget är peptid. De två talen är oberoende av varandra.

Ett frystorkat peptidpulver är aldrig 100 % peptid. Det innehåller också bundet vatten, motjoner och ibland kvarvarande salter. En typisk syntetisk peptid med 98 % renhet kan ha ett nettopeptidinnehåll på 70 till 85 %. Om en flaska är märkt med 10 mg och nettoinnehållet är 80 % innehåller flaskan 8 mg peptid. Om du behöver en exakt koncentration ska du räkna med nettoinnehållet, inte med vikten på etiketten. Nettoinnehållet bestäms vanligtvis med aminosyraanalys eller kväveanalys. Om COA:t inte anger det bör du anta att etiketten visar bruttovikten.

Motjoner: TFA och acetat

Peptider renas med HPLC med en syra i den mobila fasen. Den vanligaste syran är trifluorättiksyra (TFA). Efter rening sitter TFA kvar bundet till peptidens basiska grupper som motjon. En peptid med flera basiska aminosyror kan bära 10 till 20 % av sin vikt som TFA-salt. Roux och medarbetare granskade metoderna för att ta bort eller byta ut TFA i Journal of Peptide Science 2008 (DOI 10.1002/psc.951). Acetat är det vanliga alternativet. Det byts ut i ett extra steg och kostar mer.

Motjonen spelar roll av två skäl. För det första förändrar den nettopeptidinnehållet och därmed den verkliga mängden i flaskan. För det andra är TFA inte inert i cellbaserade analyser. Cornish och medarbetare visade 1999 i American Journal of Physiology att trifluorättiksyra som blivit kvar från reningen förändrade tillväxten hos odlade osteoblaster och kondrocyter (DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779). För cellodlingsarbete är ett acetatsalt eller ett steg som tar bort TFA det bättre valet. Ett COA som inte anger motjonen lämnar dig i ovisshet.

Vatteninnehåll, endotoxin och andra tester

Vatteninnehållet mäts med Karl Fischer-titrering och ligger vanligtvis mellan 3 och 10 % för en frystorkad peptid. Det påverkar nettoinnehållet. Endotoxin testas med LAL-test och anges i endotoxinenheter per milligram. Testet är relevant för cellbaserade analyser där bakteriella föroreningar skulle förvränga resultatet. Restlösningsmedel som acetonitril förekommer på certifikat för farmaceutisk kvalitet men sällan på certifikat för forskningskvalitet.

Tredjepartstestning kontra intern testning

Ett COA kan komma från tillverkaren, från återförsäljaren eller från ett oberoende laboratorium. Intern testning är inte fel, men den har en intressekonflikt. Ett COA från tredje part, från ett namngivet och ackrediterat laboratorium med eget rapportnummer, är starkare bevis. Det bästa fallet är en leverantör som publicerar både tillverkarcertifikatet och ett oberoende omtest av samma batch. Vår samling laboratorietestade peptider listar produkterna där batchtestning finns, till exempel BPC-157 10 mg. Kontrollera att laboratoriet finns och att batchnumret stämmer med din flaska. Ett seriöst testlaboratorium bekräftar ett rapportnummer på begäran.

Varningssignaler på ett peptidcertifikat för analys

Vissa mönster förekommer på certifikat som återanvänds, redigeras eller hittas på. Betrakta följande som varningstecken:

• Inget batchnummer, eller ett batchnummer som inte stämmer med flaskan

• En renhet på exakt 99,0 % eller 99,9 % för varje produkt och varje batch

• Inget kromatogram eller spektrum, bara ett tal i en tabell

• Observerad molekylvikt som är identisk med det teoretiska värdet till fyra decimaler

• Inget analysdatum, eller ett datum som är äldre än den angivna hållbarhetstiden

• Suddiga eller beskurna bilder som döljer laboratoriets namn

Inget av detta bevisar ensamt att en produkt är dålig. Tillsammans bör det sänka ditt förtroende. Korrekt förvaring efter leverans avgör om batchen fortfarande stämmer med certifikatet månader senare, vilket vi går igenom i vår guide om hur du förvarar peptider.

Vanliga frågor om hur man läser ett peptid-COA

Källor

• Roux S, Zékri E, Rousseau B, Paternostre M, Cintrat JC, Fay N. Elimination and exchange of trifluoroacetate counter-ion from cationic peptides: a critical evaluation of different approaches. Journal of Peptide Science. 2008. DOI 10.1002/psc.951

• Cornish J, Callon KE, Lin CQ, Xiao CL, Mulvey TB, Cooper GJ, Reid IR. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 1999. DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779

Den här artikeln beskriver laboratoriehantering av forskningssubstanser. Alla produkter på den här webbplatsen säljs endast för laboratorieforskning och är inte avsedda för användning på människor eller djur.