Puritatea peptidelor explicată: HPLC și spectrometria de masă

Puritatea peptidelor este cifra pe care fiecare furnizor o tipărește cu litere mari și, în același timp, cifra cel mai des înțeleasă greșit. O valoare de 98% provine dintr-o metodă specifică, HPLC în fază inversă, și răspunde la o întrebare specifică. Ea nu indică cantitatea de peptide din flacon și nu demonstrează că vârful principal corespunde moleculei corecte. Acest ghid explică modul în care HPLC separă o probă de peptide, ce înseamnă procentul, care sunt impuritățile tipice pentru peptidele sintetice și de ce spectrometria de masă reprezintă a doua jumătate a imaginii.

Cum măsoară HPLC în fază inversă puritatea peptidelor

HPLC înseamnă cromatografie lichidă de înaltă performanță. Proba este dizolvată și pompată sub presiune ridicată printr-o coloană umplută cu particule minuscule de silice. În HPLC în fază inversă, aceste particule sunt acoperite cu lanțuri hidrofobe de carbon, de obicei C18. Moleculele peptidice se lipesc de acest strat. Apoi, un amestec de solvenți, faza mobilă, curge prin coloană. La început, faza mobilă este în mare parte apă cu puțin acid. Pe parcursul analizei, proporția de solvent organic, de obicei acetonitril, crește treptat. Aceasta se numește gradient.

Fiecare moleculă iese din coloană în momentul din gradient în care solventul este suficient de puternic pentru a o desprinde de stratul hidrofob. Moleculele hidrofile ies devreme, iar cele hidrofobe ies târziu. Un detector de la capătul coloanei măsoară absorbanța UV, de obicei la 214 sau 220 nm, unde legătura peptidică absoarbe. Rezultatul este un cromatogram: o linie cu vârfuri, fiecare vârf reprezentând un grup de molecule care au ieșit în același moment. Mant și colaboratorii descriu metoda în detaliu în Methods in Molecular Biology (2007, DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1).

Valoarea purității se calculează din ariile vârfurilor:

Puritate (%) = aria vârfului principal / suma ariilor tuturor vârfurilor × 100

Ce înseamnă de fapt o puritate a peptidei de 98%

Procentul are un sens precis, dar restrâns. El arată că 98% din materialul care absoarbe UV și a ieșit din coloană a apărut în vârful principal. Din această definiție decurg patru limite:

• Este o valoare relativă, nu absolută. Cifra compară vârfurile între ele. Nu spune câte miligrame de peptidă există în flacon.

• Numără doar ceea ce absoarbe UV. Apa, sărurile și contraionii precum TFA nu absorb la 214 nm. Sunt invizibili pentru detector și nu reduc valoarea purității.

• Numără doar ceea ce separă coloana. O impuritate cu același timp de retenție ca produsul se ascunde în interiorul vârfului principal. O peptidă cu o metionină oxidată ieșe adesea foarte aproape de peptida-părinte.

• Depinde de metodă. Un gradient mai lung, o altă coloană sau o altă lungime de undă pot modifica cifra cu unu sau două procente pentru aceeași probă.

Pentru majoritatea lucrărilor de laborator, o puritate peste 95% este suficientă. Pentru analize cantitative sau pentru orice aplicație care necesită o concentrație molară cunoscută, ținta obișnuită este 98% sau mai mult. Mai important decât cifra este cromatograma din spatele ei. Modul de citire a acestui document este prezentat în articolul nostru despre cum se citește certificatul de analiză al unei peptide.

Impurități tipice în peptidele sintetice

Peptidele de cercetare sunt obținute prin sinteză peptidică în fază solidă. Lanțul este construit câte un aminoacid pe o bilă de rășină. Fiecare etapă are un randament de aproximativ 99%, iar erorile se acumulează pe lungimea lanțului. D'Hondt și colaboratorii au trecut în revistă clasele de impurități ale produselor peptidice în Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis în 2014 (DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012). Cele mai frecvente sunt:

• Secvențe cu deleții: lipsește un aminoacid deoarece o etapă de cuplare a eșuat. Peptida este cu un reziduu mai scurtă și de obicei iese puțin mai devreme sau mai târziu decât secvența completă.

• Secvențe trunchiate: lanțul s-a oprit din creștere devreme. Sunt fragmente mult mai scurte.

• Secvențe cu inserții: un aminoacid a fost adăugat de două ori.

• Peptide incomplet deprotejate: o grupare de protecție din sinteză este încă atașată. Acestea sunt mai hidrofobe și ies târziu.

• Forme oxidate și dezamidate: metionina, cisteina și triptofanul se oxidează; asparagina și glutamina se dezamidează. Acestea se formează în timpul sintezei, al clivajului sau al depozitării.

• Diastereomeri: un aminoacid a trecut din forma L în forma D. Sunt foarte greu de separat și se ascund adesea în vârful principal.

O peptidă lungă precum CJC-1295 are mai multe etape de cuplare și mai multe șanse de deleții decât un pentapeptid scurt precum Ipamorelin. Acesta este unul dintre motivele pentru care țintele de puritate diferă între produse. Secvențele și lungimile ambelor sunt descrise în ghidul nostru despre CJC-1295 și Ipamorelin. Depozitarea contează, de asemenea, deoarece oxidarea și dezamidarea continuă în flacon. Ghidul nostru despre cum se depozitează peptidele explică cum se poate încetini acest proces.

Spectrometria de masă confirmă identitatea, nu puritatea peptidei

Spectrometria de masă (MS) ionizează moleculele din probă și măsoară raportul masă/sarcină. Pentru peptide se folosește ionizarea prin electrosprai (ESI) sau MALDI. Dacă masa măsurată corespunde masei calculate din secvență, identitatea componentei principale este confirmată.

Aceasta este o întrebare diferită de puritate. MS arată că molecula cu masa așteptată este prezentă. Nu arată ce fracțiune din probă reprezintă acea moleculă, din trei motive:

• Molecule diferite se ionizează cu eficiențe diferite. O impuritate mică, care se ionizează bine, poate produce un vârf mare, iar produsul poate produce unul mic.

• O singură peptidă apare la mai multe mase, deoarece poate purta unul, doi, trei sau mai mulți protoni. Spectrul nu este o numărătoare simplă.

• Impuritățile cu aceeași masă ca produsul, precum diastereomerii, dau același semnal și sunt invizibile.

Și invers este valabil. HPLC poate arăta un singur vârf curat pentru o moleculă care nu este peptida dorită. O secvență cu o glicină lipsă poate arăta perfect pe cromatogramă. Doar masa dezvăluie cele 57 Da lipsă. De aceea, o analiză completă combină ambele metode, iar cele mai bune certificate provin din LC-MS, unde coloana HPLC alimentează direct spectrometrul de masă și fiecare vârf primește propria masă.

De ce puritatea peptidei nu este același lucru cu conținutul net de peptidă

Un flacon etichetat 10 mg la 98% puritate nu conține 9,8 mg de peptidă. Valoarea purității se referă doar la fracțiunea peptidică. Pudra din flacon conține și apă, contraioni și uneori săruri, pe care detectorul HPLC nu le vede. Conținutul net de peptidă este proporția din masa totală care este peptidă. Pentru o sare TFA liofilizată tipică, aceasta se situează între 70 și 85%. Calculul complet arată astfel:

Peptidă reală (mg) = greutatea de pe etichetă (mg) × conținut net de peptidă (%) × puritate (%)

Exemplu: 10 mg × 0,80 × 0,98 = 7,84 mg din secvența corectă. Dacă planificați o concentrație pentru un experiment, aceasta este cifra de utilizat. Metoda de calcul este explicată în ghidul nostru despre cum se reconstituie peptidele. Furnizorii care dozează după greutatea netă a peptidei, așa cum sunt listați în colecția noastră peptide testate în laborator, menționează acest lucru pe certificat.

Întrebări frecvente despre puritatea peptidelor

Surse

• Mant CT, Chen Y, Yan Z, Popa TV, Kovacs JM, Mills JB, Tripet BP, Hodges RS. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology. 2007. DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1

• D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012

Acest articol descrie manipularea de laborator a compușilor de cercetare. Toate produsele de pe acest site sunt vândute exclusiv pentru utilizare în cercetare de laborator și nu sunt destinate utilizării umane sau veterinare.