Cum să citești un certificat de analiză (COA) pentru peptide

Un certificat de analiză (COA) pentru peptide este documentul care îți spune ce se află de fapt într-un flacon. Acesta enumeră testele pe care un laborator le-a efectuat pe un anumit lot și rezultatele acestor teste. Un COA este singura dovadă obiectivă că pulberea corespunde etichetei. Acest ghid explică ce conține un COA bun, cum se interpretează fiecare valoare, diferența dintre puritate și conținutul net de peptide și ce semne indică un document în care nu ar trebui să ai încredere.

Ce conține un certificat de analiză pentru peptide

Un COA este întotdeauna legat de un singur lot, numit și batch. Loturile diferite ale aceluiași peptid au rezultate diferite, așa că documentul trebuie să menționeze numărul lotului tipărit pe flaconul tău. Un COA complet pentru un peptid de cercetare arată, de obicei, următoarele elemente:

• Denumirea produsului și secvența: secvența de aminoacizi sau cel puțin denumirea și formula moleculară

• Numărul lotului sau al seriei: trebuie să corespundă cu eticheta flaconului

• Greutatea moleculară teoretică și observată: din spectrometria de masă

• Puritate: din HPLC în fază inversă, exprimată ca procentaj

• Aspect: de obicei pulbere liofilizată albă

• Contraion: trifluoroacetat (TFA) sau acetat

• Conținut de apă și conținut net de peptide: dacă au fost determinate

• Endotoxine sau bioburden: pe unele certificate

• Data analizei și denumirea laboratorului de testare

Un COA cu identitate și puritate reprezintă minimul necesar. Un COA cu conținut net și contraion este mai bun, deoarece aceste valori modifică modul în care calculezi concentrațiile atunci când reconstitui peptidele.

Identitatea prin spectrometrie de masă

Spectrometria de masă (MS) măsoară masa moleculei. COA-ul listează o greutate moleculară teoretică, calculată din secvență, și o greutate moleculară observată, măsurată de instrument. Cele două valori ar trebui să coincidă în limitele de toleranță ale metodei. Pentru ESI-MS pe un peptid mic, o diferență mai mică de 1 Da este normală. O diferență mai mare arată că molecula are o modificare, cum ar fi un atom de oxigen în plus sau un aminoacid lipsă.

Multe certificate arată spectrul brut cu mai multe vârfuri. Acest lucru este de așteptat. Un peptid cu greutatea moleculară 1419 Da apare la 1420 (cu sarcină simplă, [M+H]+), la 710,5 (cu sarcină dublă) și la 474 (cu sarcină triplă). Este vorba despre aceeași moleculă, cu un număr diferit de protoni atașați.

MS confirmă ce este molecula. Nu îți spune cât din probă reprezintă acea moleculă. Aceasta este sarcina HPLC-ului, pe care îl explicăm în articolul nostru despre puritatea peptidelor, HPLC și spectrometria de masă.

Puritatea prin HPLC pe un certificat de analiză pentru peptide

HPLC în fază inversă separă proba în componentele sale și le detectează prin absorbanță UV, de obicei la 214 sau 220 nm. Rezultatul este un cromatogram cu vârfuri. Valoarea purității de pe COA este aria vârfului principal împărțită la aria totală a tuturor vârfurilor. O puritate de 98,5% înseamnă că 98,5% din materialul care absoarbe UV a eluat ca produs principal. Verifică trei lucruri:

• Lungimea de undă. 214 nm detectează legătura peptidică și vede aproape toate impuritățile. 280 nm detectează doar triptofanul și tirozina și poate ascunde impurități. Puritatea măsurată la 280 nm este mai puțin informativă.

• Cromatogramul în sine. Un COA bun arată traseul. Un vârf principal ascuțit și o linie de bază plată este imaginea dorită. Mai multe vârfuri apropiate de cel principal indică secvențe cu deleții sau forme oxidate.

• Metoda. Coloana, gradientul și durata analizei ar trebui să fie menționate. O rulare foarte scurtă poate contopi impuritățile cu vârful principal și poate face puritatea să pară mai bună decât este.

Conținutul net de peptide versus puritate

Aici greșesc cei mai mulți cititori. Puritatea îți spune ce fracțiune din materialul peptidic are secvența corectă. Conținutul net de peptide îți spune ce fracțiune din masa totală a pulberii este peptid. Cele două cifre sunt independente.

O pulbere de peptid liofilizată nu este niciodată 100% peptid. Ea conține și apă legată, contraioni și uneori săruri reziduale. Un peptid sintetic tipic cu 98% puritate poate avea un conținut net de peptide de 70 până la 85%. Dacă un flacon este etichetat cu 10 mg, iar conținutul net este de 80%, flaconul conține 8 mg de peptid. Dacă ai nevoie de o concentrație exactă, calculează cu conținutul net, nu cu greutatea de pe etichetă. Conținutul net se determină, de obicei, prin analiza aminoacizilor sau prin analiza azotului. Dacă COA-ul nu îl menționează, presupune că eticheta arată greutatea brută.

Contraionii: TFA și acetat

Peptidele sunt purificate prin HPLC cu un acid în faza mobilă. Cel mai frecvent acid este acidul trifluoroacetic (TFA). După purificare, TFA rămâne legat de grupările bazice ale peptidului ca un contraion. Un peptid cu mai multe reziduuri bazice poate avea 10 până la 20% din greutate sub formă de sare TFA. Roux și colaboratorii au analizat metodele de eliminare sau schimb al TFA în Journal of Peptide Science în 2008 (DOI 10.1002/psc.951). Acetatul este alternativa obișnuită. Acesta se schimbă printr-un pas suplimentar și costă mai mult.

Contraionul contează din două motive. În primul rând, modifică conținutul net de peptide și, prin urmare, cantitatea reală din flacon. În al doilea rând, TFA nu este inert în testele pe celule. Cornish și colaboratorii au arătat în 1999, în American Journal of Physiology, că trifluoroacetatul rămas din purificare modifica creșterea osteoblastelor și condrocitelor în cultură (DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779). Pentru lucrările cu culturi celulare, o sare de acetat sau un pas de eliminare a TFA este alegerea mai bună. Un COA care nu denumește contraionul te lasă să ghicești.

Conținutul de apă, endotoxinele și alte teste

Conținutul de apă se măsoară prin titrare Karl Fischer și se situează, de obicei, între 3 și 10% pentru un peptid liofilizat. Acesta intră în calculul conținutului net. Endotoxinele se testează prin metoda LAL și se raportează în unități de endotoxine pe miligram. Acest test este relevant pentru testele pe celule, unde contaminanții bacterieni ar distorsiona rezultatul. Solvenții reziduali, precum acetonitrilul, apar pe certificatele de calitate farmaceutică, dar rareori pe cele de calitate pentru cercetare.

Testare externă versus testare internă

Un COA poate veni de la producător, de la revânzător sau de la un laborator independent. Testarea internă nu este greșită, dar prezintă un conflict de interese. Un COA extern de la un laborator acreditat, cu nume și număr de raport propriu, reprezintă o dovadă mai solidă. Cel mai bun scenariu este un furnizor care publică atât certificatul producătorului, cât și o retestare independentă a aceluiași lot. Colecția noastră de peptide testate în laborator enumeră produsele pentru care este disponibilă testarea pe loturi, de exemplu BPC-157 10 mg. Verifică dacă laboratorul există și dacă numărul lotului corespunde cu flaconul tău. Un laborator de testare de reputație va confirma, la cerere, numărul raportului.

Semnale de alarmă pe un certificat de analiză pentru peptide

Unele tipare apar pe certificate care sunt refolosite, editate sau inventate. Consideră următoarele drept semne de avertizare:

• Lipsa numărului lotului sau un număr de lot care nu corespunde cu flaconul

• O puritate de exact 99,0% sau 99,9% pentru fiecare produs și fiecare lot

• Lipsa cromatogramei sau a spectrului, doar o cifră într-un tabel

• Greutatea moleculară observată identică cu valoarea teoretică până la patru zecimale

• Lipsa datei analizei sau o dată mai veche decât perioada de valabilitate declarată

• Imagini estompate sau decupate care ascund denumirea laboratorului

Niciunul dintre acestea nu dovedește, singur, că un produs este defect. Împreună, ar trebui să îți reducă încrederea. Depozitarea corectă după livrare decide dacă lotul mai corespunde certificatului după luni de zile, lucru pe care îl acoperim în ghidul nostru despre cum se depozitează peptidele.

Întrebări frecvente despre citirea unui COA pentru peptide

Surse

• Roux S, Zékri E, Rousseau B, Paternostre M, Cintrat JC, Fay N. Elimination and exchange of trifluoroacetate counter-ion from cationic peptides: a critical evaluation of different approaches. Journal of Peptide Science. 2008. DOI 10.1002/psc.951

• Cornish J, Callon KE, Lin CQ, Xiao CL, Mulvey TB, Cooper GJ, Reid IR. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 1999. DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779

Acest articol descrie manipularea de laborator a compușilor de cercetare. Toate produsele de pe acest site sunt vândute exclusiv pentru utilizare în cercetare de laborator și nu sunt destinate utilizării la om sau la animale.