Peptidezuiverheid uitgelegd: HPLC en massaspectrometrie

Peptidezuiverheid is het getal dat elke leverancier met grote letters vermeldt, en het is ook het getal dat het vaakst verkeerd wordt begrepen. Een waarde zoals 98% komt van één specifieke methode, omgekeerde-fase HPLC, en beantwoordt één specifieke vraag. Het vertelt je niet de hoeveelheid peptide in het flesje, en het bewijst niet dat de hoofdpiek het juiste molecuul is. Deze gids legt uit hoe HPLC een peptidemonster scheidt, wat het percentage betekent, welke onzuiverheden typisch zijn voor synthetische peptiden, en waarom massaspectrometrie de tweede helft van het verhaal is.

Hoe omgekeerde-fase HPLC peptidezuiverheid meet

HPLC staat voor high-performance liquid chromatography (vloeistofchromatografie met hoge prestaties). Het monster wordt opgelost en onder hoge druk door een kolom gepompt die gevuld is met kleine silicadeeltjes. Bij omgekeerde-fase HPLC zijn deze deeltjes bedekt met hydrofobe koolstofketens, meestal C18. De peptidemoleculen hechten aan deze coating. Vervolgens stroomt een oplosmiddelmengsel, de mobiele fase, door de kolom. Aan het begin bestaat de mobiele fase vooral uit water met een beetje zuur. Tijdens de run wordt het aandeel organisch oplosmiddel, meestal acetonitril, stap voor stap verhoogd. Dit heet een gradiënt.

Elk molecuul verlaat de kolom op het punt in de gradiënt waarop het oplosmiddel sterk genoeg is om het van de hydrofobe coating los te trekken. Hydrofiele moleculen eluteren vroeg. Hydrofobe moleculen eluteren laat. Een detector aan het einde van de kolom meet UV-absorptie, meestal bij 214 of 220 nm, waar de peptidebinding absorbeert. Het resultaat is een chromatogram: een lijn met pieken, waarbij elke piek een groep moleculen is die op hetzelfde moment eluteerde. Mant en collega's beschrijven de methode in detail in Methods in Molecular Biology (2007, DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1).

De zuiverheidswaarde wordt berekend uit de piekoppervlakten:

Zuiverheid (%) = oppervlakte van de hoofdpiek / som van alle piekoppervlakten × 100

Wat 98% peptidezuiverheid werkelijk betekent

Het percentage heeft een precieze maar smalle betekenis. Het zegt dat 98% van het UV-absorberende materiaal dat uit de kolom kwam, in de hoofdpiek terechtkwam. Uit deze definitie volgen vier beperkingen:

• Het is relatief, niet absoluut. Het getal vergelijkt pieken met elkaar. Het zegt niets over hoeveel milligram peptide er in het flesje zit.

• Het telt alleen wat UV absorbeert. Water, zouten en tegenionen zoals TFA absorberen niet bij 214 nm. Ze zijn onzichtbaar voor de detector en verlagen de zuiverheidswaarde niet.

• Het telt alleen wat de kolom scheidt. Een onzuiverheid met dezelfde retentietijd als het product verbergt zich in de hoofdpiek. Een peptide met één geoxideerd methionine elueert vaak heel dicht bij het oorspronkelijke peptide.

• Het hangt af van de methode. Een langere gradiënt, een andere kolom of een andere golflengte kan het getal bij hetzelfde monster met één of twee procent veranderen.

Voor het meeste laboratoriumwerk is een zuiverheid boven 95% voldoende. Voor kwantitatieve assays of alles wat een bekende molaire concentratie vereist, is 98% of hoger het gebruikelijke doel. Belangrijker dan het getal is het chromatogram erachter. Hoe je dat document leest, wordt behandeld in ons artikel over hoe je een peptide-certificaat van analyse leest.

Typische onzuiverheden in synthetische peptiden

Onderzoekspeptiden worden gemaakt met vastefase-peptidesynthese. De keten wordt aminozuur voor aminozuur opgebouwd op een harskorrel. Elke stap heeft een opbrengst van ongeveer 99%, en de fouten tellen op over de lengte van de keten. D'Hondt en collega's beoordeelden de onzuiverheidsklassen van peptideproducten in het Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis in 2014 (DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012). De meest voorkomende zijn:

• Deletiesequenties: één aminozuur ontbreekt omdat een koppelingsstap mislukte. Het peptide is één residu korter en elueert meestal iets eerder of later dan de volledige sequentie.

• Afgeknotte sequenties: de keten stopte vroeg met groeien. Dit zijn veel kortere fragmenten.

• Insertiesequenties: één aminozuur is twee keer toegevoegd.

• Onvolledig ontschermde peptiden: een beschermgroep uit de synthese zit nog vast. Deze zijn hydrofober en elueren laat.

• Geoxideerde en gedeamideerde vormen: methionine, cysteïne en tryptofaan oxideren; asparagine en glutamine deamideren. Deze ontstaan tijdens synthese, afsplitsing of opslag.

• Diastereomeren: één aminozuur is van de L-vorm naar de D-vorm omgeklapt. Deze zijn zeer moeilijk te scheiden en verbergen zich vaak in de hoofdpiek.

Een lang peptide zoals CJC-1295 heeft meer koppelingsstappen en meer kansen op deleties dan een kort pentapeptide zoals Ipamorelin. Dit is een reden waarom zuiverheidsdoelen tussen producten verschillen. De sequenties en lengtes van beide worden beschreven in onze gids over CJC-1295 en Ipamorelin. Opslag is ook belangrijk, omdat oxidatie en deamidering in het flesje doorgaan. Onze gids over hoe je peptiden opslaat legt uit hoe je dit vertraagt.

Massaspectrometrie bevestigt identiteit, niet peptidezuiverheid

Massaspectrometrie (MS) ioniseert de moleculen in een monster en meet hun massa-ladingsverhouding. Voor peptiden wordt elektrospray-ionisatie (ESI) of MALDI gebruikt. Als de gemeten massa overeenkomt met de massa die uit de sequentie is berekend, is de identiteit van het hoofdbestanddeel bevestigd.

Dit is een andere vraag dan zuiverheid. MS vertelt je dat het molecuul met de verwachte massa aanwezig is. Het vertelt je niet welk deel van het monster dat molecuul uitmaakt, om drie redenen:

• Verschillende moleculen ioniseren met verschillende efficiëntie. Een kleine onzuiverheid die goed ioniseert, kan een grote piek geven, en het product een kleine.

• Een enkel peptide verschijnt bij meerdere massa's omdat het één, twee, drie of meer protonen kan dragen. Het spectrum is geen eenvoudige telling.

• Onzuiverheden met dezelfde massa als het product, zoals diastereomeren, geven hetzelfde signaal en zijn onzichtbaar.

Het omgekeerde geldt ook. HPLC kan één schone piek tonen voor een molecuul dat niet het beoogde peptide is. Een deletiesequentie die één glycine te kort is, kan er op een chromatogram perfect uitzien. Alleen de massa onthult de ontbrekende 57 Da. Daarom combineert een volledige analyse beide methoden, en komen de beste certificaten van LC-MS, waarbij de HPLC-kolom rechtstreeks in de massaspectrometer uitkomt en elke piek zijn eigen massa krijgt.

Waarom peptidezuiverheid niet hetzelfde is als netto peptidegehalte

Een flesje met het opschrift 10 mg bij 98% zuiverheid bevat niet 9,8 mg peptide. De zuiverheidswaarde heeft alleen betrekking op de peptidefractie. Het poeder in het flesje bevat ook water, tegenionen en soms zouten, die de HPLC-detector niet ziet. Het netto peptidegehalte is het aandeel van de totale massa dat peptide is. Voor een typisch gelyofiliseerd TFA-zout ligt dit tussen 70 en 85%. De volledige berekening ziet er zo uit:

Werkelijk peptide (mg) = etiketgewicht (mg) × netto peptidegehalte (%) × zuiverheid (%)

Voorbeeld: 10 mg × 0,80 × 0,98 = 7,84 mg van de juiste sequentie. Als je een concentratie voor een experiment plant, is dit het getal dat je moet gebruiken. De methode voor de berekening wordt uitgelegd in onze gids over hoe je peptiden reconstitueert. Leveranciers die vullen op basis van netto peptidegewicht, zoals vermeld in onze collectie lab-geteste peptiden, vermelden dit op het certificaat.

Veelgestelde vragen over peptidezuiverheid

Bronnen

• Mant CT, Chen Y, Yan Z, Popa TV, Kovacs JM, Mills JB, Tripet BP, Hodges RS. HPLC analysis and purification of peptides. Methods in Molecular Biology. 2007. DOI 10.1007/978-1-59745-430-8_1

• D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. DOI 10.1016/j.jpba.2014.06.012

Dit artikel beschrijft het laboratoriumgebruik van onderzoeksstoffen. Alle producten op deze site worden uitsluitend verkocht voor laboratoriumonderzoek en zijn niet bedoeld voor gebruik bij mensen of dieren.