Hoe lees je een peptide-analysecertificaat (COA)

Een peptide-analysecertificaat (COA) is het document dat je vertelt wat er daadwerkelijk in een flacon zit. Het somt de tests op die een laboratorium op een specifieke batch heeft uitgevoerd, en de resultaten daarvan. Een COA is het enige objectieve bewijs dat het poeder overeenkomt met het etiket. Deze gids legt uit wat een goed COA bevat, hoe je elke waarde interpreteert, wat het verschil is tussen zuiverheid en netto peptidegehalte, en welke signalen wijzen op een document dat je niet moet vertrouwen.

Wat een peptide-analysecertificaat bevat

Een COA hoort altijd bij één batch, ook wel lot genoemd. Verschillende batches van hetzelfde peptide hebben verschillende resultaten, dus het document moet het batchnummer vermelden dat op je flacon staat. Een volledig COA voor een onderzoekspeptide toont meestal de volgende onderdelen:

• Productnaam en sequentie: de aminozuurvolgorde of op zijn minst de naam en moleculaire formule

• Batch- of lotnummer: moet overeenkomen met het etiket van de flacon

• Theoretisch en waargenomen molecuulgewicht: via massaspectrometrie

• Zuiverheid: via reversed-phase HPLC, uitgedrukt als percentage

• Uiterlijk: meestal wit gelyofiliseerd poeder

• Tegenion: trifluoroacetaat (TFA) of acetaat

• Watergehalte en netto peptidegehalte: indien bepaald

• Endotoxine of bioburden: op sommige certificaten

• Datum van analyse en naam van het testlaboratorium

Een COA met identiteit en zuiverheid is het minimum. Een COA met netto gehalte en tegenion is beter, omdat die waarden bepalen hoe je concentraties berekent wanneer je peptiden reconstitueert.

Identiteit via massaspectrometrie

Massaspectrometrie (MS) meet de massa van het molecuul. Het COA vermeldt een theoretisch molecuulgewicht, berekend uit de sequentie, en een waargenomen molecuulgewicht, gemeten door het instrument. De twee waarden moeten overeenkomen binnen de tolerantie van de methode. Voor ESI-MS op een klein peptide is een verschil van minder dan 1 Da normaal. Een groter verschil betekent dat het molecuul een modificatie draagt, zoals een extra zuurstofatoom of een ontbrekend aminozuur.

Veel certificaten tonen het ruwe spectrum met meerdere pieken. Dit is te verwachten. Een peptide met een molecuulgewicht van 1419 Da verschijnt bij 1420 (enkelvoudig geladen, [M+H]+), bij 710,5 (dubbel geladen) en bij 474 (drievoudig geladen). Dit zijn hetzelfde molecuul met een verschillend aantal aangehechte protonen.

MS bevestigt wat het molecuul is. Het vertelt je niet hoeveel van het monster dat molecuul is. Dat is de taak van HPLC, die we uitleggen in ons artikel over peptidezuiverheid, HPLC en massaspectrometrie.

Zuiverheid via HPLC op een peptide-analysecertificaat

Reversed-phase HPLC scheidt het monster in zijn componenten en detecteert ze via UV-absorptie, meestal bij 214 of 220 nm. Het resultaat is een chromatogram met pieken. De zuiverheidswaarde op het COA is de oppervlakte van de hoofdpiek gedeeld door de totale oppervlakte van alle pieken. Een zuiverheid van 98,5% betekent dat 98,5% van het UV-absorberende materiaal als hoofdproduct eluteerde. Controleer drie zaken:

• De golflengte. 214 nm detecteert de peptidebinding en ziet vrijwel alle onzuiverheden. 280 nm detecteert alleen tryptofaan en tyrosine en kan onzuiverheden verbergen. Een zuiverheid gemeten bij 280 nm is minder informatief.

• Het chromatogram zelf. Een goed COA toont het spoor. Eén scherpe hoofdpiek en een vlakke basislijn is het beeld dat je wilt zien. Meerdere pieken dicht bij de hoofdpiek wijzen op deletiesequenties of geoxideerde vormen.

• De methode. Kolom, gradiënt en looptijd moeten vermeld zijn. Een zeer korte run kan onzuiverheden samenvoegen met de hoofdpiek en de zuiverheid beter doen lijken dan ze is.

Netto peptidegehalte versus zuiverheid

Hier gaan de meeste lezers de fout in. Zuiverheid vertelt je welk deel van het peptidemateriaal de juiste sequentie heeft. Netto peptidegehalte vertelt je welk deel van de totale poedermassa überhaupt peptide is. De twee getallen staan los van elkaar.

Een gelyofiliseerd peptidepoeder is nooit 100% peptide. Het bevat ook gebonden water, tegenionen en soms restzouten. Een typisch synthetisch peptide met 98% zuiverheid kan een netto peptidegehalte van 70 tot 85% hebben. Als een flacon van 10 mg is gelabeld en het netto gehalte is 80%, bevat de flacon 8 mg peptide. Als je een exacte concentratie nodig hebt, reken dan met het netto gehalte, niet met het gewicht op het etiket. Het netto gehalte wordt meestal bepaald via aminozuuranalyse of stikstofanalyse. Als het COA het niet vermeldt, ga er dan van uit dat het etiket het bruto gewicht toont.

Tegenionen: TFA en acetaat

Peptiden worden via HPLC gezuiverd met een zuur in de mobiele fase. Het meest gebruikte zuur is trifluorazijnzuur (TFA). Na zuivering blijft de TFA als tegenion gebonden aan de basische groepen van het peptide. Een peptide met meerdere basische residuen kan 10 tot 20% van zijn gewicht als TFA-zout dragen. Roux en collega's bespraken in 2008 in het Journal of Peptide Science de methoden om TFA te verwijderen of uit te wisselen (DOI 10.1002/psc.951). Acetaat is het gangbare alternatief. Het wordt in een extra stap uitgewisseld en kost meer.

Het tegenion is om twee redenen belangrijk. Ten eerste verandert het het netto peptidegehalte en daarmee de werkelijke hoeveelheid in de flacon. Ten tweede is TFA niet inert in celgebaseerde assays. Cornish en collega's toonden in 1999 in het American Journal of Physiology aan dat restant trifluorazijnzuur na zuivering de groei van gekweekte osteoblasten en chondrocyten veranderde (DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779). Voor celkweekwerk is een acetaatzout of een TFA-verwijderingsstap de betere keuze. Een COA dat het tegenion niet noemt, laat je in het ongewisse.

Watergehalte, endotoxine en overige tests

Het watergehalte wordt gemeten met Karl Fischer-titratie en ligt voor een gelyofiliseerd peptide meestal tussen 3 en 10%. Het gaat mee in het netto gehalte. Endotoxine wordt getest met de LAL-assay en gerapporteerd in endotoxine-eenheden per milligram. Deze test is relevant voor celgebaseerde assays, waarin bacteriële verontreinigingen het resultaat zouden vertekenen. Restoplosmiddelen zoals acetonitril verschijnen op certificaten van farmaceutische kwaliteit, maar zelden op die van onderzoekskwaliteit.

Testen door derden versus intern testen

Een COA kan afkomstig zijn van de fabrikant, van de wederverkoper of van een onafhankelijk laboratorium. Intern testen is niet verkeerd, maar er speelt een belangenconflict. Een COA van derden, van een genoemd, geaccrediteerd laboratorium met een eigen rapportnummer, is sterker bewijs. Het beste geval is een leverancier die beide publiceert: het certificaat van de fabrikant en een onafhankelijke hertest van dezelfde batch. Onze collectie lab-geteste peptiden toont de producten waarvoor batchtesten beschikbaar zijn, bijvoorbeeld BPC-157 10 mg. Controleer of het laboratorium bestaat en of het batchnummer overeenkomt met je flacon. Een betrouwbaar testlaboratorium bevestigt op verzoek een rapportnummer.

Waarschuwingssignalen op een peptide-analysecertificaat

Sommige patronen komen voor op certificaten die hergebruikt, bewerkt of verzonnen zijn. Beschouw het volgende als waarschuwingssignalen:

• Geen batchnummer, of een batchnummer dat niet overeenkomt met de flacon

• Een zuiverheid van precies 99,0% of 99,9% bij elk product en elke batch

• Geen chromatogram of spectrum, alleen een getal in een tabel

• Waargenomen molecuulgewicht dat tot op vier decimalen identiek is aan de theoretische waarde

• Geen datum van analyse, of een datum die ouder is dan de vermelde houdbaarheid

• Wazige of bijgesneden afbeeldingen die de naam van het laboratorium verbergen

Geen van deze signalen bewijst op zich dat een product slecht is. Samen zouden ze je vertrouwen moeten verlagen. Correcte opslag na levering bepaalt of de batch maanden later nog overeenkomt met het certificaat, wat we behandelen in onze gids over hoe je peptiden bewaart.

Veelgestelde vragen over het lezen van een peptide-COA

Bronnen

• Roux S, Zékri E, Rousseau B, Paternostre M, Cintrat JC, Fay N. Elimination and exchange of trifluoroacetate counter-ion from cationic peptides: a critical evaluation of different approaches. Journal of Peptide Science. 2008. DOI 10.1002/psc.951

• Cornish J, Callon KE, Lin CQ, Xiao CL, Mulvey TB, Cooper GJ, Reid IR. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 1999. DOI 10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779

Dit artikel beschrijft het laboratoriumgebruik van onderzoeksstoffen. Alle producten op deze site worden uitsluitend verkocht voor laboratoriumonderzoek en zijn niet bedoeld voor gebruik bij mensen of dieren.