Steriele techniek bij het reconstitueren van peptiden
Steriele techniek bij het reconstitueren van peptiden beschermt twee dingen: het peptide in het flesje en de betrouwbaarheid van je resultaten. Een gereconstitueerde peptideoplossing wordt over meerdere weken herhaaldelijk geopend. Elke prik door de stop is een kans voor bacteriën, schimmelsporen, stof of huidcellen om binnen te komen. Eenmaal binnen groeien ze, consumeren ze het peptide en geven ze enzymen en endotoxinen af die elke assay verstoren. Deze gids beschrijft een praktische aseptische werkwijze voor een onderzoekslaboratorium, de materialen die je nodig hebt, de gangbare bronnen van verontreiniging en de norm die goede praktijk definieert.
Steriele techniek bij het reconstitueren van peptiden
Steriele techniek bij het reconstitueren van peptiden beschermt twee zaken: het peptide in het flaconnetje en de betrouwbaarheid van je resultaten. Een gereconstitueerde peptideoplossing wordt over meerdere weken herhaaldelijk geopend. Elke prik door de stopper is een kans voor bacteriën, schimmelsporen, stof of huidcellen om binnen te komen. Eenmaal binnen groeien ze, consumeren ze het peptide en geven ze enzymen en endotoxines af die elke test vertekenen. Deze gids beschrijft een praktische aseptische werkwijze voor een onderzoekslab, de benodigde materialen, de gangbare bronnen van verontreiniging en de standaard die goede praktijk definieert.
Waarom steriele techniek belangrijk is bij peptidereconstitutie
Gelyofiliseerde peptiden worden verzonden in afgesloten flaconnetjes die onder gecontroleerde omstandigheden zijn gevuld. Het risico begint wanneer je het systeem opent. Je voegt oplosmiddel toe door de stopper, je zuigt oplossing op door de stopper, en je doet beide op een werkbank met lucht, stof en oppervlakken vol micro-organismen. Bacteriostatisch water bevat 0,9% benzylalcohol, dat bacteriële groei remt, maar het doodt niet alles en het werkt niet tegen enzymen die al in het flaconnetje aanwezig zijn.
Austin en Elia evalueerden in 2009 in de Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences de gepubliceerde gegevens over microbiële besmetting van aseptisch bereide doses (DOI 10.18433/J3JP4B). Preparaten die in een ongecontroleerde omgeving werden gemaakt, waren veel vaker besmet dan preparaten die in een laminaire luchtstroomkast of een cleanroom werden bereid. De omgeving en de techniek, niet het oplosmiddel, bepalen of een flaconnetje schoon blijft.
USP 797 als referentiestandaard
De United States Pharmacopeia publiceert de standaard voor steriele bereidingen in USP General Chapter 797. Die is geschreven voor apotheken, niet voor onderzoekslaboratoria, en veel van de eisen, zoals gecertificeerde cleanrooms en milieumonitoring, gaan verder dan wat in een onderzoeksomgeving nodig is. Toch blijft het de beste referentie, omdat het de logica van aseptisch werken beschrijft: reinig de handen, reinig de oppervlakken, beheers de lucht, desinfecteer elke kritieke plek, raak nooit iets aan dat met het product in contact komt en beperk de tijd dat een bereiding wordt bewaard. De secties over handhygiëne, kleding, desinfectie van kritieke plekken en beyond-use dating zijn direct bruikbaar.
Een schone werkplek voorbereiden
De ideale plek is een laminaire luchtstroomkast. Als je er geen hebt, kies dan een werkbank uit de buurt van deuren, ramen, wastafels en looppaden, en zet ventilatoren uit die over het oppervlak blazen. Bereid daarna de ruimte voor:
Maak de werkbank leeg van alles wat niet nodig is voor de taak.
Veeg het oppervlak af met 70% isopropylalcohol en laat het drogen.
Was je handen minstens 30 seconden met zeep en droog ze af met een schone papieren handdoek.
Trek verse nitrilhandschoenen aan en veeg de handschoenen af met alcohol.
Bind haar samen en draag een labjas met gesloten mouwen.
Leg alle materialen klaar voordat je iets opent.
Praat, hoest of leun niet over de open materialen.
Materialen voor steriele peptidereconstitutie
Alles wat het oplosmiddel of de oplossing raakt, moet steriel zijn en eenmalig worden gebruikt. De lijst is kort:
Steriele wegwerpspuiten in een maat die past bij het volume, bijvoorbeeld 1 mL of 3 mL. Open de verpakking pas direct voor gebruik.
Steriele wegwerpnaalden, één voor het opzuigen van het oplosmiddel en een nieuwe voor elke volgende afname. Een naald die één keer is gebruikt, is niet langer steriel.
Steriele alcoholswabs, elk afzonderlijk verpakt.
Bacteriostatisch water in een afgesloten meerdoseflacon, zoals ons bacteriostatisch water 10 mL. Het volledige assortiment oplosmiddelen en verbruiksartikelen vind je in onze collectie bacteriostatisch water en laboratoriumbenodigdheden.
Een steriel spuitfilter van 0,22 µm, optioneel, voor oplossingen die in celkweek worden gebruikt of langer worden bewaard.
Etiketten, een permanente marker en een container voor scherpe afval.
Gebruik nooit een spuit opnieuw, ook niet voor dezelfde flacon op dezelfde dag. Raak nooit de naaldschacht, de punt van de spuit of de binnenkant van een dop aan. Deze oppervlakken heten kritieke plekken en mogen alleen in contact komen met steriel materiaal.
Stap-voor-stap steriele techniek bij peptidereconstitutie
De basismethode voor reconstitutie, inclusief de concentratieberekening, wordt uitgelegd in onze gids over hoe je peptiden reconstitueert. De volgende stappen voegen de aseptische discipline toe aan die methode:
Laat het peptidflacon op kamertemperatuur komen in de gesloten doos. Een koud flaconnetje openen trekt vocht uit de lucht in het poeder.
Verwijder de afneembare doppen van beide flacons. De rubberen stopper eronder is aan de buitenkant niet steriel.
Veeg elke stopper af met een verse alcoholswab en laat de alcohol volledig drogen. Dit duurt ongeveer 30 seconden.
Open de spuit en bevestig de naald zonder de punt of de naaldhouder aan te raken.
Zuig lucht op in de spuit ter grootte van het volume oplosmiddel, steek de naald door de stopper van het oplosmiddel en duw de lucht erin. Dit egaliseert de druk.
Zuig het oplosmiddel langzaam op en verwijder luchtbellen terwijl de naald nog in het flaconnetje zit.
Steek de naald onder een hoek in het peptidflacon, met de schuine kant naar het glas gericht, en laat het oplosmiddel langs de binnenwand lopen. Spuit het niet op het poeder.
Trek de naald terug en gooi haar meteen weg in de container voor scherpe afval.
Draai het flaconnetje voorzichtig rond tot het poeder is opgelost. Niet schudden.
Veeg de stopper opnieuw af voordat je het flaconnetje bewaart, en plaats er indien beschikbaar een nieuwe dop of steriele afdekking op.
Herhaal voor elke volgende afname dezelfde volgorde: afvegen, laten drogen, nieuwe naald en spuit, opzuigen, weggooien, afvegen, bewaren.
De oplossing filteren
Een spuitfilter van 0,22 µm verwijdert bacteriën en schimmelsporen, maar niet virussen of endotoxines. Filteren is nuttig wanneer de oplossing in celkweek gaat of langer dan enkele weken wordt bewaard. Zuig de hele oplossing op in een steriele spuit, bevestig het filter en duw de oplossing langzaam in een nieuw steriel flaconnetje. Peptiden kunnen zich hechten aan filtermembranen, dus gebruik een filter met lage eiwitbinding, zoals PVDF of PES, en reken op een kleine materiaalverlies. Voor oplossingen die je binnen korte tijd gebruikt, is filteren niet nodig.
Etikettering en documentatie
Een flaconnetje zonder etiket is een flaconnetje dat je niet kunt gebruiken. Schrijf het volgende op elk gereconstitueerd flaconnetje:
Peptidenaam en batchnummer uit het analysecertificaat
Oplosmiddel en totaal toegevoegd volume
Resulterende concentratie in mg/mL
Datum en tijdstip van reconstitutie
Je initialen
Noteer dezelfde gegevens in je labjournaal. USP 797 noemt de limiet voor de bewaartijd de beyond-use date. Voor een onderzoeksflacon in bacteriostatisch water bij 2 tot 8 °C stellen veel laboratoria deze op vier weken. Bewaaromstandigheden na reconstitutie worden behandeld in onze gids over hoe je peptiden bewaart.
Veelvoorkomende bronnen van verontreiniging
De meeste besmette flacons zijn terug te voeren op een paar fouten:
De naald inbrengen voordat de alcohol op de stopper is gedroogd
De naald of de punt van de spuit aanraken met een vinger of tegen de werkbank
Een spuit of naald hergebruiken voor een tweede afname
Het flaconnetje zonder dop op de werkbank laten staan
Een oplosmiddelflacon gebruiken die al maanden open staat
Een troebele oplossing, zichtbare deeltjes of een vliesje op het oppervlak zijn tekenen van verontreiniging. Gebruik zo'n flacon niet. Gooi hem weg en reconstitueer een nieuwe. Producten uit ons assortiment lab-getest peptiden worden geleverd met een certificaat dat de zuiverheid van de batch op het moment van testen aantoont. Steriele techniek houdt de oplossing na het openen op die kwaliteit.
Veelgestelde vragen over steriele techniek bij peptiden
Kan ik een 70% ethanolspray gebruiken in plaats van swabs?
Hoe vaak mag ik een meerdoseflacon bacteriostatisch water doorprikken?
Verwijdert het filter van 0,22 µm endotoxines?
Bronnen
United States Pharmacopeia. General Chapter 797: Pharmaceutical Compounding, Sterile Preparations. usp.org/compounding/general-chapter-797
Austin PD, Elia M. A systematic review and meta-analysis of the risk of microbial contamination of aseptically prepared doses in different environments. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2009. DOI 10.18433/J3JP4B
Dit artikel beschrijft de laboratoriumhantering van onderzoeksstoffen. Alle producten op deze site worden uitsluitend verkocht voor laboratoriumonderzoek en zijn niet bedoeld voor gebruik bij mensen of dieren.
